2020-01-14
5766
Потребляемый организмом кислород практически полностью (95-98%) расходуется на выработку энергии и окислительный катаболизм субстратов, и лишь малая его часть переходит в активные формы кислорода (уровень АФК в тканях равен примерно 10-8М).
Конфигурация внешней электронной оболочки атома кислорода 2S22P4. Молекула кислорода двухатомна. В основном состоянии (триплетное 3∑-g) два валентных электрона молекулы О2, находящиеся на разрыхляющих орбиталях πх и πу, не спарены (рис. 25) и, таким образом, молекула кислорода является бирадикалом. Помимо основного, существуют еще два долгоживущих возбужденных состояния О2 - синглетное 1Δg (энергия возбуждения 94,1 кДж/моль, время жизни 45 мин) и синглетное 1∑+g (энергия возбуждения 156,8 кДж/моль).
Рисунок 25: Схема распределения электроном по атомным орбиталям молекулы кислорода.
Существует также аллотропная модификация кислорода - азон О3.Озон образует озониды, в которых ионная форма кислорода - О-3. Молекула кислорода образует три различные ионные формы, каждая из которых дает начало классу соединений: О-2 - супероксидам, О22- - пeроксидам, О+2 - диоксигенильным соeдинениям.
Молекула кислорода, присоединяя дополнительный электрон, образует высоко реакцион-носпособный супероксид-радикал (•О2-). Супероксид может порождать вторичные АФК:
- присоединяя еще один электрон, образует короткоживущий пероксид-анион (•О22-), который легко связывает протоны и вследствие этого переходит в Н2О2
- присоединяя NO, образует пероксинитрит (образуется при избытке О2-)
- переводит трехвалентное железо Fe3+ в двухвалентное Fe2+, которое при взаимо-действии с Н2О2, НClО и липоперекисями образует гидроксильный радикал ОН* или липоксильный радикал LO* (образуется при избытке О2-)
- присоединяя 2 протона и электрон, образует перекись кислорода Н2О2 (основной продукт).
Присоединение электрона к Н2О2 ведет к расщеплению молекулы на ионы О2- и О-. В то время как О2- путем присоединения двух протоны образует воду, протонирование О- приводит к особо опасному гидроксил-радикалу (ОН-). Присоединение еще одного электрона и заключительное протонирование ОН- заканчивается образованием воды (рис. 26).
Донорами электронов могут быть Fe2+, Cu+ (из активных центров) или семихиноны, а для второй и третей реакций – также и О2-:
Рисунок 26: АФК.
В клетке активные формы кислорода возникают в результате различных окислитель-восстановительных реакций, протекающих в ней. К АФК относятся супероксид анион-радикал O2.-, перекись водорода H2O2, гидроксильный радикал (ОН-), синглетный O2, озон O3, гипохлорид НClО, окись азота NO и ряд других кислородсодержащих веществ, обладающих высокой окислительной активностью и способных повреждать редокс-чувствительные компоненты клетки, прежде всего белки, липиды и нуклеиновые кислоты.
Раньше полагали, что АФК являются исключительно токсичными для клетки метаболитами и поэтому в клетке существует множество систем для борьбы с ними. Но по мере изучения АФК стало ясно, что они не всегда пагубно влияют на клетку.
К настоящему времени накопилось немало сведений о сигнальной роли АФК, хотя конкретных метаболических путей, в которых могут участвовать АФК, в большинстве случаев еще не выявили. Так, например, есть данные, что АФК участвуют в качестве сигнальных молекул при активации транскрипционных факторов AP-1 и NF-κB и индукции экспрессии генов при иммунном ответе. АФК могут выступать и в качестве индукторов клеточной гибели или наоборот, ингибировать цитотоксическое действие терапевтических препаратов на опухолевые клетки [44]. Возможно, что АФК могут выступать в роли митотических стимуляторов.
Существуют также данные об участии АФК в регуляции редокс-статуса и окислительных модификаций белков.
Регуляция редокс-сигнализации может осуществляться как через общий уровень глутатиона (GSH) в клетке, так и через соотношение GSH/GSSH (рис.29). Глутатион (трипептид Glu-Cys-Gly) находитсяся почти во всех клетках в высокой концентрации и содержит нетипичную γ-связь между Glu и Cys. Восстановителем здесь является тиольная группа цистеинового остатка. Две молекулы восстановленной формы (GSH) при окислении образуют дисульфид (GSSG) (рис. 27). Окислительные модификации затрагивают, как правило, остатки цистеина в функциональных доменах различных белков, приводя к инактивации ферментов, изменению способности связывания транскрипционных факторов с ДНК и другим функциональным нарушениям. При понижении уровня восстановленного глутатиона нарушается проведение сигнала от ряда рецепторов факторов роста и связывание транскрипционных факторов с ДНК, подавляется рост и размножение многих клеточных типов.
Рисунок 27: Глутатион.
Источником АФК в клетке является множество различных ферментативных и неферментативных систем. Одним из главных генераторов АФК в клетке являются пероксисомы, в которых локализован целый ряд образующих перекись водорода ферментов. Эта перекись используется клеткой в основном для детоксикации ксенобиотиков, и практически вся утилизируется внутри этих органелл. В гладком эндоплазматическом ретикулуме локализован ряд цитохром-зависимых оксигеназ, продуцирующих супероксид O2 . –. Очень много образуется АФК в эритроцитах. В плазмалемме макрофагов и эндотелиоцитов существует НАД(Ф)Н-оксидазная система, продуцирующая супероксид анион в ходе иммунного и воспалительного ответа. Остеокласты (специализированные макрофаги) применяют АФК для разрушения кости – обязательное условие ее обновления. При этом клетки-защитники быстро поглощают большое количество O2 (дыхательный взрыв), образуя внешней стороны мембраны супероксид O2 .– за счет окисления цитозольного НАД(Ф)Н.
В клетках образование АФК происходит еще и потому, что в дыхательной цепи митохондрий происходит утечка электронов с комплексов I и III и за счет этого в среднем около 2% поступающего кислорода переходит в активную форму, при этом часть АФК идет на оксидативную модификацию макромолекул. Продукция O2 .– в митохондриях осуществляется несколькими различными путями и значительно зависит от активности дыхания (состояние 3 или 4) и изменений парциального давления кислорода (гипоксия или реоксигенация). Митохондрии более всех других органелл подвержены атаке АФК и, как следствию, повреждению мембранных липидов, углеводов, белков и ДНК, причем для гибели митохондриям не требуется никаких дополнительных белков, кроме тех, которые присутствуют в них самих. Окислительный стресс является причиной множества дегенеративных заболеваний, старения и гибели клетки.
Основным местом утечки электронов из дыхательной цепи и, следовательно, образования O2 .– является убихинол цитохром с оксидоредуктаза, где генерация происходит за счет одноэлектронного восстановления молекулярного кислорода от убисемихинона [43]. В НАДН-убихинон-редуктазе источником O2 .– служит семихиноновая форма флавина. При изменении интенсивности потока электронов и степени восстановленности компонентов дыхательной цепи митохондрий йзменяется и количество выпадающих электронов. Так, например, в присутствии цианида и ротенона продукция супероксида понижается, а при добавлении ингибитора комплекса III антимицин А (приводит к увеличению пула семихинонов), образование АФК в следствии окисления субстрата I или II комплексами увеличивается, в то время как (рис.28).
В условиях высокого Δψ в дыхательной цепи усиливается обратный транспорт элект-ронов, и тогда главным продуцентом супероксида становиться комплекс I. При повыше-нии митохондриального трансмембранного потенциала (Δψ) становится дыхательная цепь становиться более восстановленной, что увеличивает образование АФК в Q-цикле.
Рисунок 28: Электрон-транспортная цепь и сайты генерации АФК. Антиоксидантные системы клетки[15]
Как уже было сказано выше, АФК очень реакционноспособные и легко переходят из одной формы в другую (рис. 29), окисляя при этом различные молекулы. Так, в результате утечки электронов из дыхательной цепи и в реакциях НАД(Ф)Н-оксидазы и ксантин-оксидазы первым образуется супероксид анион радикал, который очень быстро дисмутирует до перекиси водорода.
Из всевозможных восстановленных форм кислорода перекись водорода является самым стабильным соединением и обладает меньшей реакционной способностью, нежели другие формы. Молекула H2O2 способна перемещаться в клетке на значительные расстояния и довольно долго сохраняться в ней. Скорее всего, перекись не достаточно активна, чтобы как-то сильно повредить клеточным структурам, а играет роль сигнальной молекулы. При этом в присутствии активаторов, как-то: ионов меди и ионов железа (образуются при окислении железо - серных центров ряда ферментов кислородными радикалами), - из перекиси и супероксида образуется гидроксильный радикал. Гидроксильный радикал является самым опасным и обладает наивысшей реакционной способностью среди всех АФК. Он мог бы разрушить практически все клеточные структуры, но имеет очень маленькое время жизни (около нескольких наносекунд) и не способен диффундировать на значительные расстояния от места образования.
Также супероксид способен реагировать с оксидом азота (II) (обладает сосудо-расширяющим действием) с образованием активного оксиданта пероксинитрита.
При избытке супероксида, он может переводить трехвалентное железо Fe3+ в двухвалентное Fe2+, которое при взаимодействии с Н2О2, НClО и липоперекисями образует гидроксильный радикал ОН* или липоксильный радикал LO*.
+H+
Fe2+ + H2O2 [(FeIV=O)2+ + H2O] Fe3+ + H2O + HO.
Cu+ + H2O2+ H+ [(CuIII-OH)2+ + H2O] Cu2+ + H2O + HO.
Рисунок 29: Переход из одних форм АФК в другие и воздействие на клетку.
Когда митохондрии перестают справляться с проблемой детоксикации образуемых ими АФК, усиливается дисбаланс между их (АФК) генерацией и нейтрализацией, что приводит к так называемому окислительному стрессу. В результате избыточного образования кислородных радикалов, последние начинают выполнять в основном деструктивные функции, нежели служат в качестве сигнальных молекул. Происходят специфические изменения множества клеточных компонентов: повреждаются мембранные структуры из-за перекисного окисления липидов, происходит окисление белков по остаткам тирозина, цистеина и серина, повреждение ДНК, смещение редокс-потенциала клетки из-за окисления глутатиона и НАД(Ф)Н.
Так, примером действие АФК в условиях, способствующих их избыточному образованию, может служить избыток O2, особенно при гипербарической оксигенации (лечение кислородом под повышенным давление), сильного спазма (характерен для инфаркта миокарда или инсульта головного мозга) и реперфузии миокарда после периода ишемии (возобновление кровотока после его нарушения из-за тромбоза, т.е. закупорки сосуда), сопровождающаяся развитием повреждений, сопоставимых по степени с возникшими в результате самой ишемии. Механизм образования АФК при реперфузии, вероятно, обусловлен созданием условий, благоприятствующих образованию вторичных радикалов. Во время ишемии парциальное давление кислорода в кардиомиоцитах резко снижается, и это сопровождается переходом окисленных атомов железа Fe3+ в восстановленные Fe2+, а также повышением активности ксантиноксидазы. Оба эти компонента при появлении в цитоплазме больших количеств кислорода в начале реперфузии резко активируют образование ОН*, и возникающее под действием этого радикала повреждение клеточных структур может приобретать необратимый характер, что вызывает развитие апоптоза
Самым распространенным патологическим состоянием, приводящим к значительной вспышке продукции АФК, является гипоксия и последующая реоксигенация. В ходе продолжительной гипоксии происходит множество изменений в активности ряда клеточных ферментов, истощение и повреждение антиоксидантных защитных систем и быстрое восстановление компонентов дыхательной цепи за счет обращения АТФ-синтазной реакции, используемой для создания протонного градиента в условиях недостатка кислорода. В результате всех этих изменений при последующей реоксигенации утечка электронов с комплексов дыхательной цепи и генерация супероксида значительно увеличивается.
В условиях нормоксии повышенная генерация активных форм кислорода, приводящая к окислительному стрессу, наблюдается обычно только в очагах воспаления. В данном случае кислородный взрыв обусловлен деятельностью НАДФН-оксидазных систем макрофагов и является жестко регулируемым, оказывая деструктивное влияние только на клетки, на которые направлена иммунная реакция.
Поскольку образование АФК в клетках любых аэробных организмов происходит непрерывно, то клетках должны быть и защитная система против их пагубного влияния.
Антиоксиданты.
Защита клетки от избытка кислородных радикалов и снижение вызванных ими окислительных повреждений осуществляется двумя принципиально разными механизмами:
1. снижение образования первичных АФК (супероксида) путем уменьшения кислорода в клетке или его более быстрого использования дыхательной цепью ввиду снятия ее контроля ∆μН+
2. функционированием антиоксидантной системы, которая включает антиоксидантные ферменты, низкомолекулярные соединения, образующие редокс-буфер, витамины, альбумины, свободные жирные кислоты и комплексоны ионов металлов (рис. 30).
К нейтрализующим АФК ферментам относятся супероксиддисмутазы (СОД), каталаза и пероксидазы. СОД катализирует дисмутацию двух молекул супероксида с образованием перекиси водорода и O2. Изоформы этого фермента присутствуют во всех клеточных компартментах, где возможно образование супероксида, нейтрализуя O2.-. Образующаяся при дисмутации супероксида перекись нейтрализуется каталазой или глутатион- и тиоредоксин- пероксидазами в пероксисомах.
Внутриклеточный редокс-статус обеспечивается системой тиолов, в первую оче-редь глутатиона (GSH) и тиоредоксина (TRX), которые создают буферную систему для поддержания более восстановленных по сравнению с внеклеточной средой условий.
Глутатион (GSH) и тиоредоксин (TRX) являются важнейшими антиоксидантами в клетке. Глутатион участвует в поддержании редокс-статуса за счет нейтрализации перекиси глутатион-пероксидазой.
Образовавшейся НАДФН+Н+ поставляет Н+ для регенерации восстановленного глутатиона (GSH) из глутатион-дисульфида (GSSG) с помощью глутатион-редуктазы.
В условиях окислительного стресса соотношение GSН/GSSG быстро падает из-за окисления глутатиона, но быстро восстанавливается до исходного уровня. При этом в организме в случае исчерпания GSH в какой-либо ткани, обеспечение может происходить за счет выброса его в кровь из депо (печень) [49]. Тиоредоксин действует как восстановитель дисульфидных связей в белках и донор электронов для TRX-пероксидазы, при это не оказывая влияния на продукцию АФК или количество восстановленного глутатиона. Восстанавливается тиоредоксин с помощью тиоредоксин-редуктазы и НАДФН [50].
Когда митохондрии перестают справляться с проблемой детоксикации АФК, происходит разрушение митохондриальных структур от мембраны до мтДНК. Из АФК только ОН- вызывает повреждения ДНК (окисление оснований, их модификации, повреждение хромосом). Подобные мутации могут привести к патологии и гибели клеток или их злокачественному перерождению (раки, лейкозы).
АФК может повреждать мембраны митохондрий. Так, на первый взгляд не очень опасная молекула пероксида водорода может генерировать гидроксил-радикал в присутствии двухвалентного железа или превращаться в гипохлорит-анион ОСl–ферментом миелопероксидазой. Как гипохлорит-анион, так и гидроксил-радикал являются сильными окислителями. Они способны модифицировать белки, нуклеиновые кислоты, индуцировать перекисное окисление липидов (от которого наиболее сильно «страдают» полиненасыщенные жирными кислотами, входящими в состав мембранных липидов). Так, при перекисном окисление липидов кислородный радикал, чаще всего это бывает гидроксил-радикал, который хорошо проникает в мембраны, будучи незаряженным, отнимает атом водорода от молекулы жирной кислоты с образованием перекисного радикала жирной кислоты. Этот радикал запускает цепную реакцию, взаимодействуя с другой жирной кислотой, в ходе которой образуются перекись кислоты и новый радикал:
LH + HO . → L . + H2O
L . + O2 → LOO .
LOO . + L′ H → LOOH + L′ ., и так далее.
Таким образом, затрагивается значительное количество клеточных липидов, и повреждаются мембраны. Кроме того, может происходить и амплификация окислительного повреждения за счет распада гидроперекисей на два новых радикала, каждый из которых запускает свою цепь.
Процессы, протекающие до момента образования гипохлорит-аниона или гидроксил-радикала, локализованы в цитоплазме и контролируются цитоплазматическими ферментами или природными водорастворимыми антиоксидантами. Например, таурин способен связывать гипохлорит-анион в форме хлораминового комплекса, дипептид карнозин и его производные нейтрализуют гидроксил-радикал, а такие соединения, как белое ферритин, связывают железо. Большое значение для предотвращения перекисного окисления липидов, инициируемое в гидрофобном пространстве клеточных мембран, и уничтожения радикалов жирных кислот имеет гидрофобный локализованный в мембранах α-токоферол (витамин Е). Его высокая концентрация в биологических мембранах препятствует их повреждению свободными радикалами. Витамин Е обрывает цепные реакции образования липидных пероксилов, превращаясь в радикал, который регенерирует как с помощью активных водорастворимых восстановителей типа аскорбата и глутатиона, так и с помощью гидрофобного убихинола (см. ниже).
АФК бывают трех типов (Ю.А. Владимиров):
- Первичные (индуцирующие) - образуются при окислении некоторых молекул; к ним относятся оксид азота NO и супероксид О2 -; обладают регуляторным или умеренным антимикробным действием.
- Вторичные - образуются вследствие атаки супероксида других молекул;к ним относятся гидроксильный радикал ОН*, липоксильный радикал LO* и пероксинитрит; обладают сильным токсическим действием вследствие своей способности необратимо повреждать мембранные липиды, а также молекулы ДНК, углеводов и белков
- Третичные - образуются вследствие соединения вторичных радикалов с молекулами антиоксидантов и других легко окисляющихся соединений; их роль может быть различной
В рамках общей концепции окислительного стресса большое значение имеет феномен АФК-индуцированного образования АФК [52]. При этом небольшие количества индуцирующих АФК приводят к падению трансмембранного потенциала и активная генерация вторичных АФК, что приводит к развитию «окислительного взрыва». Предположительно в ходе АФК-индуцированного образования АФК происходит окисление неких белков и регуляторных тиолов, которые изменяют редокс-статус клетки, инициируя неспецифическую проницаемость мембран. Хоть неспецифическую проницаемость и носит обратимый характер, но все же приводит к нарушению функционирования электрон-транспортной цепи, изменению свойств мембран и, в конечном счете, к “окислительному взрыву”.
При повреждении комплекса I дыхательной цепи происходит прямое окисление белков, разрушение железосерных кластеров, нитрозилирование и глутатионилирование, вследствие чего сильно снижается его активность, что происходит, например, при ишемической болезни сердца (и, как следствия, реперфузии).
При повреждении белков наиболее уязвимыми являются следующие аминокислоты: цистеин, метионин, тирозин, триптофан, фенилаланин, валин, лейцин, гистидин, глутамил, пролин, треонон, аргинин, лизин (табл. 3).
Таблица 3: Модификации аминокислот.
| аминокислота | Модифицированный продукт |
| Цистеин | Cys-Cys, HNE-Cys |
| Метионин | Метионин сульфоксид |
| Тирозин | дитирозин, нитротирозин, хлоротирозин, dopa |
| Триптофан | Гидрокси- и нитро-триптофан, кинуренин |
| Фенилаланин | гидроксифенилаланин |
| Валин, лейцин | Гидро(перо)ксиды |
| Гистидин | 2-оксогистидин, аспарагин, аспартат, HNE-His |
| Глутамил | щавеливая кислота, пировиноградная кислота |
| Пролин | гидроксипролин, пирролидон, глутаминовый семиальдегид |
| Треонин | 2-Amino-3-ketobutyric acid |
| Аргинин | глутаминовый семиальдегид, хлорамин |
| Лизин | α-Aminoadipic семиальдегид, хлорамины, MDA-Lys, HNE-Lys, акролеин-Lys, карбоксиметиллизин, pHA-Lys |
АФК разрушают белки, разделяя их на меньшии пептиды (рис.30). Это происходит следующим образом.
Гидроксил радикал отнимает притон от -CH(R)- группы белка, образую воду (реакции a и b). Образовавшийся алкил радикал может либо связаться со вторым алкил радикалом (реакция р), либо прореагировать с кислородом, образовав алкил пероксид радикал (реакция с). Далее алкил пероксид радикал, присоединяя протон, образует алкил пероксид. Протон он получает реагируя либо с Fe2+ (реакция g), либо с пероксильным радикалом (НО2*) (реакция f). Алкил пероксид белка может реагировать с таким же пероксидом (дисмутация), высвобождая кислоров и образуя алкокси белок (реакция о). Алкокси белок может также образовываться путем восстановления алкил пероксида либо Fe2+ (реакция g), либо пероксильным радикалом (НО2*) (реакция f).
Рисунок 30: Окисление белков по α-амидному и диамидному путям.
Дальнейшее преобразование алкокси белока может пойти двумя альтернативными путями:
- α-амидный путь: алкокси белок может преобразовываться в гиброксильную производную (реакция i, j), пептидня связь которой подвергается в дальнейшем расщеплению (реакция k, l),
- диамидный путь (реакция m).
В итоге исходный белок разделяется на более мелкие пептиды, что приводит к его дисфункции.
АФК значительно влияют на концентрации ионов кальция в матриксе и цитоплазме, провоцируя закачку Са2+ в цитоплазму из внеклеточного пространства и внутриклеточных депо, а в матрикс из цитоплазмы, путем активации кальциевых транспортеров [51].
Еще одно уязвимое место дыхательной цепи - Q-цикл. В двух Q-связывающих сайтах комплекса III происходит генерация убисемихинон анион радикала. Убисемихинон, образовавшийся в Qp сайте, способен реагировать с молекулярным кислородом с образованием убихинона и супероксида:
UQ .– + O2 → UQ + O2 .–.
В сайте QN активное взаимодействие радикала с кислородом не наблюдается из-за хорошей стабилизации радикала и его глубокого относительно толщи мембраны расположения, так, что кислороду трудновато до него добраться.
При связывании антимицина А с сайтом QN окисление убисемихинона в сайте Qp предотвращается, увеличивается его время существования, что повышает вероятность формирования O2 .–. Супероксид инициирует цепной процесс автоокисления коэнзима, легко окисляя его с образованием новых молекул убисемихинона. Таким образом, одним из главных источников активных форм кислорода в митохондриях является Q-цикл.
Замечательное свойство убисемихинон состоит в том, что образующийся молекулы убисемихинон легко включается в Q-цикл, при этом легко и быстро регенерируя убихинол в ходе постоянно идущего естественного процесса транспорта электронов в дыхательной цепи. Убихинол, свою очередь, проявляет ярко выраженные свойства антиоксиданта, предотвращая перекисное окисление мембранных липидов (см. выше) [35]. Убихинол достаточно эффективно обрывает цепной процесс образования перекос-ных радикалов, превращаясь в убисемихинон, который затем может реагировать с новы-ми липидными радикалами, а также диспропорционировать с образованием UQ и UQH2:
UQH2 + L . / LOO . → UQH . + LH / LOOH
UQH . + L . / LOO . → UQ + LH / LOOH
UQH . + UQH . → UQ + UQH2
В любом случае, образующиеся формы CoQ способны включаться в Q-цикл, и тем самым антиоксидант убихинол постоянно регенерируется.
Кроме явного проявления антиоксидантных свойств путем непосредственного взаимодействия с АФК, убихинол принимает еще и опосредованное, неявное участие в борьбе с клеточными вредителями. Убихинол восстанавливает другой важнейший жирорастворимый антиоксидант – витамина Е: убихинол взаимодействует с α-токофероксил радикалом с образованием убисемихинон радикала, который регенерируется за счет взаимодействия с другими радикалами или включения в Q-цикл дыхательной цепи (рис. 31).
Замечательно то, что антиоксидант убихинол, принимая на себя удар, может регенерироваться, вступая своей окисленной формой в Q-цикл, быстро восстанавливаясь в ходе постоянно идущего естественного процесса транспорта электронов в дыхательной цепи.
В ряде работ также показано участие UQH2 в предотвращении окисления мембранных белков и ДНК [37]. Митохондриальная ДНК является еще одной мишенью для АФК. Высокая концентрация активных форм кислорода в митохондриях и слабая система репарации увеличивают частоту мутаций мтДНК по сравнению с ядерной на порядок. Радикалы кислорода служат причиной специфических замен Ц®Т (дезаминирование цитозина) и Г®Т (окислительное повреждение гуанина), вследствие чего, возможно, мтДНК богаты АТ-парами. Повреждение мтДНК особенно опасно в связи с постепенным накоплением мутаций, длительным эффектом АФК. В митохондриальном геноме закодирован ряд важнейших уникальных митохондриальных белков и повреждение ответственных за них генов приводит к нарушениям в их экспрессии и последующем функционировании. Прослеживается четкая корреляция между возрастом и накоплением мутаций в мтДНК, падением эффективности дыхания и увеличением продукции АФК, что легло в основу митохондриальной теории старения [53].
Рисунок 31: Про-оксидативные и антиоксидантные свойства кофермента Q [37].
Аналоги убихинона.
Таким образом, коэнзим Q является антиоксидантом клетки. Многие заболевания и общее старение организма связано с тем, что митохондрии не справляются с детоксикацией АФК. Поэтому изучение и возможное терапевтическое применение антиоксидантов (в частности, CoQ и его аналогов) представляет очень большой интерес. Можно попытаться распознать функцию CoQ, изменяя содержание CoQ внутри митохондрий, но для повышения концентрации CoQ в митохондрии необходимо адресовано ввести кофермент в изолированные митохондрии, клетки или же организмы. Вследствие гидрофобности и соответственно низкой растворимости в водной среде возникает проблема доставки CoQ и, следовательно, и его изучения in vitro.
Для повышения концентрации аналогов хинонов, животным в течение нескольких недель дают пищу обогащенную хинонами, так что во всех тканях устанавливается стабильная необходимая для исследований концентрация. Эти соединения могут с помощью кровотока равномерно распределяться в тканях; так их активные формы были обнаружены в наиболее подверженных окислительному стрессу тканях, то есть в мозге, печени, сердце и мышцах животных. При этом концентрация аналогов хинонов в митохондриях в несколько сот раз выше, чем в кровотоке. Аналоги хинонов при необходимости легко выводятся из тканей, возвращаясь опять в кровь и достаточно быстро экскрегируются из организма при отмене диеты.
Гидрофобность коэнзима определяется в первую очередь его боковой изопреноидной цепью. Менее гидрофобные, но по-прежнему активные производные CoQ могут быть получены путем замены длинной боковой цепи на более водорастворимые «хвосты». Такие производные CoQ широко используются в качестве электронных доноров и акцепторов при изучении ферментов и для повышения содержания коэнзима в митохондриях и клетках. Биологическая активность подобных искусственно синтезированных аналогов CoQ должна в значительной степени сохраняться, так как в передаче электронов участвует бензохиноновое кольцо, а боковая цепь выполняет только функцию заякоривания молекулы в мембране.
Как правило, такие производные (рис. 32) имеют либо очень короткую боковую цепь из одной - двух изопреноидных звеньев в позиции 6 (коэнзимы Q1, Q2), либо более простую алифатическую боковую цепь без разветвлений (децилубихинон) или модифицированную гидроксилом или другой гидрофильной группой (например 10-гидроксидецил в идебеноне) [75]. В любом случае, даже подобные аналоги CoQ все еще достаточно гидрофобны, и, при попытке их введения в биологические системы, неспецифично включаются во все фосфолипидные бислои, и только маленькая часть попадает в митохондриальные мембраны.
Для адресной доставки коэнзима Q в митохондрии перспективно использование конъюгатов с так называемыми липофильными катионами, в том числе с трифенилфосфонием.
Так, аналоги кофемента Q, ковалентно связанные с катионами трифенилфосфония, образуют ряд молекул (рис.34):
- MitoQ (mitochondria-targeted ubiquinone)-производное хинона, ковалентно связанное с катионом алкилТРР; MitoQ10 -хинол, у которого в качестве боковой цепи алкильная цепь из 10 углеродов с ТРР+ на конце.
- Mito Vit Q (mitochondria-targeted derivative of α-tocoferol),
- spin traps (Mito PBN, mitochondria-targeted derivative of the spin trap phenylbutylnitrone),
- TBTP, IBTP (тиоловые зонды),
- MitoDC81 (DNA alkylating reagent).
Еще в 1969 году Скулачевым и коллегами было показано потенциал-зависимое накопление дибензиламмония в митохондриальном матриксе, что дало толчок к изучению накопления липофильных катионов энергизованными митохондриями [72]. Накопление дибензиламмония было весьма слабым и требовало наличия противоиона, в качестве которого использовался липофильный анион тетрафенилборат. В дальнейших исследованиях использовался другой катион– метилтрифенилфосфоний, который не нуждается в противоионе. Таким образом, катионы трифенилфосфония (ТРР) стали применяться в качестве зондов при изучении функций митохондрий.
Рисунок 32: производные коэнзима Q
Липофильные катионы, несмотря на положительный заряд, имеют высокую растворимость в липидах, легко проходят через мембраны бислоя без участия ионофоров и аккумулируются в митохондриях в клетки, движимые высоким потенциалом митохондриальной мембраны. Подобное свойство обусловлено гораздо меньшей по сравнению с гидрофильными катионами типа Na+ энергией активации перехода иона из водной среды в липидное окружение. Эта энергия определяется электростатической и гидрофобной составляющими.
Основной вклад в электростатическую компоненту вносит энергия Бора, которая представляет собой вклад энтальпии, необходимый для удаления гидратирующих катион молекул воды при переносе в липидную фазу из водного раствора. Энергия Бора обратно пропорциональна ионному радиусу катиона, что обусловлено пониженной гидратацией катиона при распределении заряда по большей площади поверхности, которая в этом случае имеет меньшую напряженность электрического поля, поляризующего молекулы воды. Липофильные катионы представляет собой фосфоний, окруженный тремя гидрофобными фенильными группами, за счет чего имеют большойим ионныйм радиус около 4 Ǻ. Таким образом, включение в мембранный бислой липофильных катионов типа тетрафенилфосфония с большим ионным радиусом в 4, 2 Ǻ гораздо менее энергетически невыгодно, чем поглощение маленьких катионов типа Na+ с радиусом ~1 Ǻ.
Помимо энергии Бора существует еще две электростатических составляющих, но которые вносят значительно меньший вклад. Первая обусловлена электростатическими свойствами на границе раздела фаз с различной диэлектрической проницаемостью, а вторая связана с локальным электрическим потенциалом, возникающим во внутренней части мембраны благодаря ориентации диполей карбонильных групп жирных кислот в фосфолипидах. Существование этой дипольной силы объясняет факт о значительно более быстром проникновении анионов сквозь бислой по сравнению с катионами.
В целом электростатические силы препятствует переносу катиона из водной в липидную фазу. Однако существует не менее важная компонента энергии перемещения, обусловленная гидрофобностью катиона. Она способствует включению его в бислой за счет положительного гидрофобного эффекта, который заключается в повышении энтропии, связанном с нарушением структуры воды. Гидрофобный эффект оценивается примерно в 92 Дж/моль на Ǻ2 доступной растворителю поверхности, и, к примеру, для тетрафенилфосфония выигрыш в энергии составит порядка 29 кДж/моль. Помимо этого, гидрофобный эффект возникает сразу после поглощения катиона мембраной, тогда как увеличение отталкивающих электростатических сил возникает постепенно при прохождении через мембрану. Вследствие этого в энергетическом профиле перемещения катиона сквозь бислой помимо центрального энергетического барьера имеются потенциальные «ямы» рядом с поверхностью мембран. Катионы связываются с мембраной, попадают в потенциальную «яму» у поверхности и быстро проходят сквозь гидрофобный центр к противоположной потенциальной «яме», после чего десорбируются в раствор по другую сторону барьера. Таким образом, катионы находяться в динамическом равновесии между формами, связанными с поверхностью внутренней мембраны и свободными формами в растворе, при этом в связанном состоянии находиться примерно 60% ТРМР и 85% тетрафенилфосфония (ТРР). Т.е. в перемещении липофильных катионов через фосфолипидный бислой можно выделить три стадии: адсорбцию, транслокацию и десорбцию (рис.33).
Рисунок 33: Накопление MitoQ10 в митохондрии в ответ на мембранный потенциал Δψ.
Связывание производных трифенилфосфония происходит в большей степени по мере роста гидрофобности боковой цепи из-за увеличения движущей силы энтропийной природы. К примеру, константа ассоциации с бислоем увеличивается в 10 раз при пере-ходе от ТРМР к амилТРР и в 6 раз при переходе к тетраТРР. При этом для всех производных группа ТРР ассоциируется с мембраной в одном и том же положении на гидрофобной стороне раздела липид/вода при одновременном проникании боковой цепи в мембрану, поэтому даже самые гидрофобные производные ТРР быстро проходят сквозь бислой, не задерживаясь в нем из-за липофильности алкильной цепи. Это подтверждается коэффициентами распределения производных ТРР в системе октанол/фосфатный буфер, имитирующей внешний мембранный слой, которые относительно велики: 0,35 у ТРМР и 160 у MitoQ10. При этом коэффициент распределения в имитирующей середину бислоя с низкой диэлектрической постоянной системе циклогексан/вода для MitoQ10 незначителен.
Таким образом, в отсутствии мембранного потенциала в условиях деэнергизованных митохондрий катионы связываются с наружной стороной мембраны, затем преодолевают гидрофобный энергетический барьер липидного бислоя, сявзываются с внутренней стороной мембраны и, наконец, десорбируются в митохондриальный матрикс.
При наличии Δψ перемещение катионов через мембрану приводит к их накоплению в митохондриальном матриксе в соответствии с уравнением Нернста. При Δψ около 60 мВ концентрация катионов в матриксе увеличивается в 10 раз, а при митохондриальном Δψ в 140-180 мВ – в сотни раз (рис. 36).Мера накопления катионов в ответ на мембранный потенциал Δψ описывается уравнением Нернста, где z - это заряд на катион.
При этом уравнение Нернста оперирует концентрациями несвязанных катионов. Значительная часть проникших в митохондрии катионов ТРР связана с внутренней мембраной, что обусловлено большим объемом внутренней мембраны по сравнению с объемом матрикса. Повышение гидрофобности производного приводит к увеличению адсорбции.
Так, при 37°С до логарифмирования фактор равен 61мВ (для монокатионов), в то время как in vivo – приблизительно 120-180 мВ, а концентрация липофильных монокатионов увеличивается в 100-1000 раз внутри митохондрии (используется для измерения Δψ и обнаружения митохондрий в клетке) [76].
Рисунок 34: Адресная доставка в митохондрии с помощью катионов ТРР+ (by Murphy, 2004, [19]).
В свете описанных свойств катионов ТРР+, ковалентное присоединение незаряженных биологически активных соединений к катионам ТРР+ должно приводить к их адресной доставке внутрь митохондрий под действием высокого мембранного потенциала, что позволит исследовать различные вещества и использовать их в терапевтических целях. Рассмотрим некоторые производные хининов поподробнее.
Так аналоги кофемента Q, ковалентно связанные с катионами алкилтрифенилфосфо-ния, образуют молекулы MitoQ (рис.32), которые имеют различную длину боковой цепи.
Так, например, MitoQ10 – это хинол, у которого в качестве боковой цепи алкильная цепь из 10 углеродов с ТРР+ на конце (рис.32). Эксперименты в данном направлении на изолированных митохондриях и клетках показали, что MitoQ10 эффективно накапливается в митохондриях, включаясь во внутреннюю митохондриальную мембрану со стороны матрикса. Изопреноидный хвост CoQ располагается в центре бислоя параллельно поверхности, заякоривая молекулу внутри мембраны; бензохиноновое кольцо CoQ также погружено в мембрану, но способно менять свою пространственную ориентацию, тем самым, обеспечивая перенос электронов. Молекула же MitoQ ориентирована иначе: бензохиноновое кольцо локализуется в толще бислоя, изопреноидный хвост перпендикулярен поверхности мембраны, а объемный катион ТРР находится на поверхности мембраны, обращенной в матрикс (рис. 35). Для гомологов CoQ c достаточно длинной боковой цепью молекулярная динамика и минимизация энергии показали свернутую структуру молекулы: последняя изопреноидная единица находится в тесном контакте с бензохиноновым кольцом.
Рисунок 35: Ориентация CoQ и MitoQ оносительно мембранного бислоя.
Тем не менее, MitoQ10 может окисляться и восстанавливаться митохондриальной дыхательной цепью и это в основном происходит в активных центрах дыхательных комплексов, а не за счет эндогенного пула убихинонов [74]. Было показано, что MitoQ10 может принимать электроны вблизи комплексов I и II и передавать их на комплекс III, возможно, конкурируя при этом с CoQ, а также эффективно блокирует окислительные повреждения [75].
Таким образом возможно осуществлять и направленный транспорт CoQ в составе MitoQ10, который способен выполнять функции антиоксиданта, а также блокировать многие из предполагаемых путей митохондриальной редокс-сигнализации и регуляции метаболизма, в том числе повреждение теломер, активацию UCP и пути, включающие в себя р53 [73].
Mito Vit Q – это аналог кофемента Q, являющийся производным α-токоферола (рис.32). Поскольку и CoQ и витамин Е проявляют антиоксидоньные свойства и предотвращают перекисное окисление липидов, то был синтезирован аналог убихинона Mito Vit Q. in vitro показано, что Mito Vit Q быстро и избирательно аккумулируются в изолированных митохондриях и в митохондриях изолированных клеток.
Помимо окислительных повреждений, АФК могут выполнять еще и сигнальную функцию, механизм которой пока еще малоизучен. Адресованные антиоксиданты могут так же использоваться для выслеживания сигнальных путей. Так с помощью Mito PBN (spin trap) (рис. 32) показали, что супероксид индуцирует активацию разъединения белков через образование из карбонильных радикалов фосфолипидов [73]. Mito PBN также модулирует роль продукции АФК в предполагаемых сигнальных путях внутри клетки.
Таким образом, катионы ТРР (трифенилфосфония), связанные с антиоксидантами и другими зондами, избирательно направляют их (связанные с ТРР молекулы) в митохондрии внутри клеток и in vivo. Это использует для изучения окислительного повреждения и, возможно, лечения вызываемых АФК заболеваний.
Ученые стремились улучшить количество и селективность доставки антиоксидантов в митохондрии iv vivo, заменив липофильный монокатион на дикатион (рис.30), который теоретически должен был быть значительно более эффективным. Подобное предположение возникло исходя из уравнения Нернста: на каждое повышение мембранного потенциала на 60мВ дикатионы накапливаются 100-кратном размере внутри митохондрии, (по сравнению с деситекратным увеличение для монокатионов), давая 100-1000 кратное увеличение по сравнению с монокатионами. Подобное увеличение было бы весьма значительным в усовершенствовании разрабатываемой терапии.
Рисунок 36: Моно- и дикатионы трифенилфосфония
Мало что известно про взаимодействие липофильных дикатионов с митохондриальной мембраной и про пределы накопления дикатионов в митохондриях. Было проведено всего несколько экспериментов по взаимодействию дикатионов с митохондриями и ни один из них не показал, что дикатионы накапливаются в соответствии с уравнение Нернста [76]. Липофильные катионы проходять сквозь мембраны за счет гидрофобности катиона и низкой энергии Бора. Энергия Бора для дикатионов в четыре раза выше чем для монокатионов, а значит дикатионы должны быть более гидрофобными, чтоб переноситься через мембраны наравне с монокатионами.
После проведения ряда экспериментов стало ясно, что дикатионы накапливаются в митохондриях при повышении мембранного потенциала примерно на 90-100мВ. Потому нецелесообразно применять дикатионы в роли векторов для доставки антиоксидантов в митохондрии. При низком мембранном потенциале (in vitro) дикотионов значительно больше нежели монокатионов, поэтому дикотионы могут использоваться для измерения мембранного потенциала.
Представляет очень большой интерес изучение как функций и механизмов действия естественных антиоксидантов клетки, так и их аналогов и дальнейшее возможное их терапевтическое применение. Окислительный стресс с накоплением в тканях и биологических жидкостях АФК и вторичных продуктов оксидативно модифицированных молекул обнаружены при многих (более 60) болезнях и патологических синдромах, нередко называемых свободно-радикальной патологией: старении тканей и всего организма, различных злокачественных процессах, хроническом воспалении (ревматоидный артрит, гастрит и язва, колиты, цистит и другие), СПИДе, сахарном диабете, атеросклерозе, последствиях инфаркта и инсульта, катаракте, нейродегенеративных заболеваниях (паркинсонизм, болезнь Альцгеймера и другие) и многих других. Вот только первично ли возникновение АФК или же накопление их является следствием патогенеза пока не совсем ясно. Несомненно, что избыточность АФК повреждает клетки и тем самым способствует развитию заболеваний, поэтому-то и необходимо изучение и создание новых неприродных антиоксидантов, которые совместно с клеточными антиоксидантами могли бы поддерживать АФК на допустимом для нормального фнкционирования клетки уровне.
Список литературы:
[1] Chen, L.B., Summerhayes, I.C., Johnson, L.V., Walsh, M.L., Bernal, S.D., and Lampidis, T.J. (1982) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 46,141–155
[2] Heggeness, M.H., Simon, M., and Singer, S.J. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75, 3863–3866
[3]Ball, E.H. and Singer, S.J. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79,123–126
[4] Johnson, L.V., Walsh, M.L., and Chen, L.B. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77,990–994
[5] Тихонов А. Н.// СОЖ, 1999,№ 6, с.17 - 24.
[6]Kunau W.-H., Buhue S., De La Garza M. et al. // Biochem. Soc. Trans. 1988, 16, p. 418-420.
[7] Hackenbrock, C.R., Chazotte, B., and Gupte, S.S. (1986) J. Bioenerg. and Biomembr. 18, 331–368
[8] Chazotte, B. and Hackenbrock, C.R. (1991) J. Biol. Chem. 266, 5973–5979
[9] Ferreira G. C., Pratt R. D., Pedersen R. L // J. Biol. Chem. 1989, 264, P. 15628-15633.
[10] Perkins, G., Renken, C., Martone, M.E., Young, S.J., Ellisman, M., and Frey, T. (1997) J. Struct. Biol. 119, 260–272
[11] Fawcett, D.W. (1981) in The Cell (pp. 410–485), W.B.Saunders, Philadelphia
[12] Schatz G., Dobberstein В. // Science. 1996. V. 271, Р. 1519-1526
[13] Neupert W. // Annu, Rev. Biochem. 1997. V. 66. P. 863-917
[14] Pfanner N., Craig Е.A., Malinger A. // Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 1997. V. 13. P. 25-51
[15] Gray, M.W. and Doolittle, W.F. (1982) Microbiol. Rev. 46, 1–42
[16] Gray, M.W. (1992) Int. Rev. Cytol. 141, 233–357
[17] Nass, S. and Nass, M.M.K. Ultramitochondrial fibers with DNA characteristics. J. Cell. Biol. 19,593–629. 1963.
[18] Palmer, J.D. (1997) Nature 387,454–455
[19] Lang, B.F., Burger, G., O’Kelly, C.J., Cedergren, R., Golding, G.B., Lemieux, C., Sankoff, D., Turmel, M., and Gray, M.W. (1997) Nature 387,493–497
[20] Linnane, A.W., Lamb, A.J., Christodoulou, C., and Lukins, H.B. (1968) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 59, 1288–1293
[21] Lamb, A.J., Clark-Walker, G.D., and Linnane, A.W. (1968) Biochim. Biophys. Acta 161,415–427
[22] Towers, N.R., Dixon, H., Kellerman, G.M., and Linnane, A.W. (1972) Arch. Biochem. Biophys. 151, 361–369
[27] Hatefi Y. // Ann. Rev. Biochem. 1985, 55, p. 1015-1069
[28] Anderson S., De Bruijn H. L, Colison R. A. et al. // J. Mol. Biol. 1982, 156, p. 683-717
[29]Виноградов А. Д., "Биохимия", 1986, т. 51, в. 12, с. 1944-73.
[30] Festenstein G. N., Heaton F. W., Lowe J. S., Morton R. A.,// A constituent of the unsaponifable portion of animal tissue lipids. (λmax 272 mμ.), Biochem. J. 59 (1955) 558-566.
[31] Crane F. L., Hatefi Y., Lester R. L., Widmer C.,// Isolation of a quinone from beef heart mitochondria, Biochem. Biophys. Acta 25 (1957) 220-221.
[32] Wolf D. E., Hoffman C. H., Trenner N. R., Arison B. H., Shunk C. H., Linn B. O., McPherson J. F., Folkers K., //Coenzyme Q. Structure studies on the coenzyme Q group, J. Am. Chem. Soc. 80 (1958) 4750-4752
[33] Ernster L., Lee I.Y., Norling B., Persson B.,// Studies with ubiquinone-depleted submitochondrial particles. Essentiality of ubiquinone for the interaction of succinate dehydrogenase, NADH dehydrogenase, and cytochrome b, Eur. J. Biochem.9 (1969) 299-310.
[34] Mitchell P.,// Protonmotive redox mechanisms of cytochrome b-c1 complex in the respiratory chain: protonmotive ubiquinone cycle, FEBS Lett. 56 (1975) 1-6.
[35] James A. M., Smith R. A. J., Murphy M. P.,// Antioxidant and prooxidant properties of mitochondrial Coenzyme Q, Arch Biochem Biophys. 423(1) (2004 Mar 1) 47-56.
[36]Gibson F,// Chemical and genetic studies on the biosynthesis of ubiquinone by Escherichia coli, Biochem. Soc. Trans. 1 (1973) 317-326.
[37]Turunen M., Olsson J., Dallner G.,// Metabolism and function of coenzyme Q, Biochem. Biophys. Acta 1660(1-2) (2004) 171-99.
[38] Klingenberg M., Huang S. G.,// Structure and function of the uncoupling protein from brown adipose tissue, Biochem. Biophys. Acta 1415 (1999) 271-296.
[39] Fontaine E., Bernardi P.,// Progress on the mitochondrial permeability transition pore: Regulation by complex I and ubiquinone analogs, J. Bioenerg. Biomembranes 31 (1999) 335-345 [40] E. Fontaine, P. Bernardi, Progress on the mitochondrial permeability transition pore: Regulation by complex I and ubiquinone analogs, J. Bioenerg. Biomembranes 31 (1999) 335-345.
[41] D. R. Green, J. C. Reed, Mitichondria and apoptosis, Science 281 (1998) 1309-1312.
[42] L. Walter, V. Nogueira, X. Leverve, M. P. Heitz, P. Bernardi, E. Fontaine, Three classes of ubiquinone analogs regulate the mitochondrial permeability transition pore through a common site, J. Biol. Chem. 275 (2000) 29521-29527.
[43] Q. Chen, E. J. Vazquez, S. Moghaddas, C. L. Hoppel, E. J. Lesnefsky, Production of reactive oxygen species by mitochondria, J Biol Chem. 278(38) (2003 Sep 19) 36027-31.
[44] C. Fluery, B. Mignotte, J. L. Vayssiere, Mitochondrial reactive oxygen species in cell death signaling, Biochimie 84(2-3) (2002) 131-141.
[45] Литошенко А. Я.,// Эволюция митохондрий,Цитология и генетика, том 36, № 5, (2002), 49-57
[46] Минченко А.Г.,// Дударева Н.А. Митохондриальный геном, Новосибирск, (1990).
[47] Дымшиц Г.М.,// Сюрпризы митохондриального генома, Природа, №6 (2002), С.10—18
[48] Гвоздев В.А.,// Сорос. образоват. Журн, №10, (1999), С.11—17.
[49] Urso M. L., Clarkson P. M.,// Oxidative stress, exercise, and antioxidant supplementation, Toxicology 189 (2003) 41-54.
[50] Li C., Jakson R. M.,// Reactive species mechanisms of cellular hypoxia-reoxygenation injury, Am. J. Physiol. Cell Physiol. 282 (2002) C227-C241
[51] Ghosh A., Greenberg M. E.,// Calcium signaling in neurons, molecular mechanisms and cellular consequences, Science 268(5208) (1995) 239-247.
[52] Zorov D. B.,. Filburn C. R, Klotz L. O.,. Zweier J. L,. Sollot S. J,// Reactive oxygen species (ROS)-induced ROS release, a new phenomenon accompanying induction of the mitochondrial permeability transition in cardiac myocites, J. Exp. Med. 192 (2000) 1001-1014.
[53] Papa S., Skulachev V. P.,// Reactive oxygen species, mitochondria, apoptosis and aging, Molecular and Cellular Biochemistry, 174 (1997) 305-319.
[54] Виноградов А.Д., Преобразование энергии в митохондриях, // Соросовский образовательный журнал, 1999, №9, с. 11-19.
[55] Кольман Я., Рем К.Г., Рем К.-Г.,// Наглядная биохимия, Издательство:Мир, (2004).
[56] A. Bremer, U. Aebi, The structure of the F-actin filament and the actin molecule, Curr. Opin. Cell Biol. 4 (1992) 20.
[57] H. Chen, S.A. Detmer, A.J. Ewald, E.E. Griffin, S.E. Fraser, D.C. Chan, Mitofusins Mfn1 and Mfn2 coordinately regulate mitochondrial fusion and are essential for embryonic development, J. Cell Biol. 160 (2003) 189
[58] S. Cipolat, O.M. de Brito, B. Dal Zilio, L. Scorrano, OPA1 requires mitofusin 1 to promote mitochondrial fusion, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (2004) 15927.
[59] D.W. Cleveland, Microtubule MAPping, Cell 60 (1990) 701.
[60] D.W. Cleveland, K.F. Sullivan, Molecular biology and genetics of tubulin, Annu. Rev. Biochem. 54 (1985) 331.
[61] M.L. Garcia, D.W. Cleveland, Going new places using an old MAP: tau, microtubules and human neurodegenerative disease, Curr. Opin. Cell Biol. 13 (2001) 41.
[62] H. Herrmann, U. Aebi, Intermediate filaments: molecular structure, assembly mechanism, and integration into functionally distinct intracellular Scaffolds, Annu. Rev. Biochem. 73 (2004) 749.
[63] A. Kodama, T. Lechler, E. Fuchs, Coordinating cytoskeletal tracks to polarize cellular movements, J. Cell Biol. 167 (2004) 203.
[64] M.A. McNiven, Dynamin: a molecular motor with pinchase action, Cell 94 (1998) 151.
[65] M. Moritz, D.A. Agard, Gamma-tubulin complexes and microtubule nucleation, Curr. Opin. Struct. Biol. 11 (2001) 174.
[66] M. Schliwa, G. Woehlke, Molecular motors, Nature 422 (2003) 759.
[67]D.I. James, P.A. Parone, Y. Mattenberger, J.C. Martinou, hFis1, a novel component of the mammalian mitochondrial fission machinery, J. Biol. Chem. 278 (2003) 36373.
[68] L. Scorrano, Proteins that fuse and fragment mitochondria in apoptosis: con-fissing a deadly con-fusion? J. Bioenerg. Biomembr. 37 (2005) 165.
[69] J.M. Shaw, J. Nunnari, Mitochondrial dynamics and division in budding yeast, Trends Cell Biol. 12 (2002) 178.
[70] E. Smirnova, L. Griparic, D.L. Shurland, A.M. van der Bliek, Dynaminrelated protein Drp1 is required for mitochondrial division in mammalian cells, Mol. Biol. Cell 12 (2001) 2245.
[71] M.A. Welte, Bidirectional transport along microtubules, Curr. Biol. 14 (2004) R525–R537.
[72] E. A. Liberman, V. P. Topali, L. M. Tsofina, A. A. Jasaitis, V. P. Skulachev, Nature, 222 (1969) 1076-1078.
[73] M. P. Murphy, Investigating mitochondrial radical production using targeted probes, Biochem Soc Trans.32(6) (2004) 1011-4.
[74]Kelso G. F., Porteous C. M., Coulter C. V., Hughes G., Porteous W. K., Ledgerwood E. C., Smith R. A., Murphy M. P., Selective targeting of a redox-active ubiquinone to mitochondria within cells: antioxidant and antiapoptotic properties, J Biol Chem. 276(7) (2001) 4588-96.
[75] R. A. Smith, G. F. Kelso, A. M. James, M. P. Murphy, Targeting coenzyme Q derivatives to mitochondria, Methods Enzymol. 382 (2004) 45-67.
[76] Meredith F. ROSS, Tatiana DA ROS†1, Frances H. BLAIKIE, Tracy A. PRIME, Carolyn M. PORTEOUS, Inna I. SEVERINA, Vladimir P. SKULACHEV, Henrik G. KJAERGAARD, Robin A. J. SMITH and Michael P. MURPHY//, Accumulation of lipophilic dications by mitochondria and cells, Biochem. J. (2006) 400, 199–208 (Printed in Great Britain)
