Санитарно-микробиологическое исследование микробиота человека, микрофлоры полости рта, аутомикрофлоры кожи

4 часа

 

Цель занятия:

1. Овладеть методами отбора проб и санитарно-бактериологического ис­следования микрофлоры полости рта.

2. Описать микрофлору зубного налета, слизистой оболочки зева на основании данных микроскопического исследования;

3. выделить и произве­сти количественный учет некоторых групп микроорганизмов из слизистой обо­лочки зева.

Содержание занятия:

1. Провести отбор проб и микроскопическое исследование зубного налета, слизистой оболочки зева.

2. Произвести посев на питательные среды, выделить и произве­сти количественный учет некоторых групп микроорганизмов из слизистой обо­лочки зева. Результаты записать в тетрадь.

 

Материалы и оборудование: стерильные пипетки 2 мл и 5 мл; ватный тампон на палочке; 0,85%-й раствор NaCl стерильный или вода водопроводная сте­рильная по 4,5 мл в пробирках; вата; микроскопы; стекла предметные и покровные. Вода водопроводная стерильная; среды: Эндо, молочно-солевой или желточно-солевой агар, МПА, среда Сабуро, 5%-ный кровяной агар, сахарный бульон или "Mitis Salivarius Agar ”, среда Вильсона - Блера; реактивы для окраски по Граму; фуксин; 70%-й этанол.

 

Методические указания:

Полость рта является исключительно благоприятной средой для существо­вания и размножения самых различных видов микроорганизмов. Это обусловлено постоянным наличием питательных веществ, оптимальной для размно­жения многих микроорганизмов температурой (37°С), влажностью и рН (око­ло 6,9 - 7,0).

По данным разных авторов, количество бактерий в слюне колеблется от 43 млн. до 5,5 млрд. в 1 мл, т.е. в среднем 750 млн. в 1 мл.

Микробный состав полости рта здоровых людей представлен в таблице 1. Микрофлора полости рта подразделяется на постоянную и слу­чайную. Обычными представителями нормальной микрофлоры ротовой поло­сти являются стрептококки: факультативно анаэробные (в том числе Streptococcus salivarius, S. mitis, кариесогенные - S. mutans и др.) и облигатные анаэробы (Peptostreptococcus), а также грамположительные нитевидные микроорганизмы (Actinomyces viscosus). В составе микрофлоры полости рта можно обнаружить также лактобациллы, грамотрицательные кокки, относящиеся к родам Neisseria и Velionella, а также грамотрицательные бактерии, строгие анаэробы из семей­ства Bacteroidaceae (Bacteroides, Fusobacterium, Leptotrichid). В состав постоянной микрофлоры полости рта входят различные виды спирохет (Treponema denticola, Т. orale, Т. macrodenticum, Borrelia buccalis), микоплазмы, нокардии и др. К слу­чайной микрофлоре полости рта относятся комменсалы, обитающие на других слизистых оболочках и коже, сапрофиты внешней среды и различные патоген­ные микроорганизмы, которые попадают в полость рта в результате аэроген­ного или алиментарного заражения от больных или бактерионосителей. Очень высокой способностью адаптироваться к существованию в ротовой полости обладают стафилококки, стрептококки, коринебактерии, грибы Candida, ви­русы герпеса, эпидемического паротита и др.

Таблица 32

Микробный пейзаж полости рта здоровых лиц.

 

МИКРООРГАНИЗМЫ	%
Стрептококки	100
Лактобактерии	90,3
Стафилококки	40,7
Грибы рода Candida	25,7
Бактероиды	23,9
Коринебактерии	15,1
Нейссерии	7,9
Вейлонеллы	5,3
Лептотрихии	4,5
Фузобактерии	3,5
Микрококки	2,7

 

 Для изучения качественного и количественного состава микрофлоры полости рта исследуется:

• зубной налет,

• слизистые оболочки щеки,

• десны,

• неба,

• поверхность языка

• ротовая жидкость.

В 1 мг. зубного налета, по данным разных авторов, содержится от 5 до 800 млн. микроорганизмов. Микроорганизмы зубного налета делят на две большие группы: 1 - бактерии ацидофильные, к которым относятся виды, способные развиваться в кислой среде; 2 -протеолитические микроорганизмы, вырабатывающие протеиназы.

Забор материала для микробиологического анализа производится натощак или через 3-4 ч после еды. Перед взятием материала рекомендуется рот прополоснуть кипяченой водой.

 

Задание 1. Провести микробиологическое исследование зубного налета и смывов со слизистой оболочки зева.

Проведение анализа. Зубной налет для исследования собирается стерильным экскаватором. Полученный материал взвешивается на аналитических весах с последующим разведением от 1:100 до 1:1000 и посевом на питательные среды.

 Из зубного налета, смывов со слизистой оболочки зева готовят препараты-мазки, окрашивают по методу Грамма их и микроскопируют (рис. 7).

Из зубного налета также готовят препарат «раздавленная капля» для обнаружения подвижных мик­роорганизмов

На обычное предметное стекло наносят небольшое количество зубного налета, осторожно накрывают покровным стеклом, так, чтобы между стеклами не образовались пузырьки воздуха и налет распределился равномерно. Осторожно опускают объектив среднего увеличения и микроскопируют.

 

 

Рис.7 Микрофлора зубного налета       (по Л. В. Борисову и др., 1993):

 

1 — Leptotrichia buccalis; 2 — Lactobacillus sp.; 3, 4 — Treponema denticola, Treponema, sp.; 5, 6 — стрептококки и диплококки (Streptococcus salivarius, S. mitis, S. sanguis, Veilonella sp.); 7— Fusobacterium nucleatum

 

.

Задание 2. Провести бактериологическое исследование ротовой жидкости и зубного налета.

Забор материала со слизистых оболочек и поверхности языка проводится стерильным ватным тампоном с площади 1 см.² и последующим высевом на питательные среды.

 Ротовая жидкость собирается в стерильную пробирку, исследуется 0,1 мл.

Идентификация выделенных штаммов микроорганизмов осуществляют на основании морфологических, культуральных и биохимических признаков в соответствии с определителем бактерий Д. Берги (1988).

 Количественный учет плотности популяций различных экологических групп производится путем подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ) в одном грамме зубного налета, 1 мл ротовой жидкости на 1 см.² поверхности языка и слизистых оболочек щеки, десны и неба.

Для посевов берут определенный объем исследуемого материала (напри­мер, смыв из зева или зубной налет), разводят в стерильной воде (в зависимо­сти от предполагаемой концентрации) и делают посевы из соответствующих разведений на питательные среды: 5% кровяной агар, для подсчета общего микробного обсеменения, для выявления стафилококка - на молочно-солевой или желточно-солевой агар; сахарный бульон и "Mitis Salivarius Agar ” - для стрептококков, растительно-молочную среду для лактобактерий, среду Сабуро с полимексином - для грибов рода Candida, среду Вильсона - Блера для анаэробов, для выявления бактерий группы ки­шечной палочки - на среду Эндо; для выявления дрожжей рода Candida - на среду Сабуро.

Посевы инкубируются в термостате 24 часа, среда Сабуро около 5 дней.

Ориентировочную идентификацию микроорганизмов проводят по характеру выросших колоний, морфологии клеток, окраске по Граму.

 

Задание 3.Определение аутомикрофлоры кожи

 

Данная методика позволяет оценить не только загрязнение кожи микроорганизмами, но и наличие штаммов с признаками патогенности – гемолитические, маннитсбраживающие формы. В норме на пластинках с питательными средами вырастают немногочисленные колонии, даже на кровяном агаре их число редко превышает 10-30, бактерицидность кожи составляет 80%. Увеличение обсемененности кожи микроорганизмами, изменение качественного состава микрофлоры (появление большого количества гемолитических, маннитсбраживающих штаммов, кишечных бактерий) свидетельствует о снижении бактерицидности барьерных свойств кожи.

Проведение анализа:

1. Пластинки с кровяным агаром, со средами Коростелева и Эндо длиной 2 см, шириной 1 см, толщиной 0,5 см вырезают стерильным скальпелем или (лучше) специальным шаблоном из чашки Петри с этими питательными средами, укладывают их на предметное стекло так, чтобы расстояние между пластинками составляло около 1 см.

2. Предметное стекло с пластинками прикладывают к участкам кожи, предплечья, живота и бедра для определения состава поверхностной микрофлоры.

3. Те же участки кожи протирают слабым (0,25%-ным) раствором нашатырного спирта, и после его подсыхания на кожу вновь накладывается предметное стекло с питательными средами для характеристики глубокой аутомикрофлоры кожи.

4. Все предметные стекла укладывают в стерилизатор, на дне которого находится влажная фильтровальная бумага, и помещают на 24 ч в термостат при 37 °С. Через 24 ч по росту на кровяном агаре определяют общую микробную обсемененность кожи и наличие штаммов с гемолитическими свойствами: по росту на среде Коростелева – наличие на коже главным образом стафилококков, в том числе и сбраживающих манит (желтые колонии); по росту на среде Эндо - наличие главным образом кишечных бактерий.

Контрольные вопросы:

1. Расскажите о микрофлоре полости рта.

2. Правила отбора проб и микробиологическое исследование зубного налета и смывов со слизистой зева.

3. Расскажите об определении аутомикрофлоры кожи.

Пульчеровская Л.П

Золотухин С.Н.

 Васильев Д.А.