Глава 3 Результаты исследований и их обсуждение

3.1 Изучение особенностей лектин-индуцированной продукции Н₂О₂ нейтрофилами с пониженным содержанием холестерина

Для исследования особенностей лектин-индуцированной продукции Н₂О₂ нейтрофилами с пониженным содержанием холестерина регистрировали кинетики тушения флуоресценции скополетина, возникающие при взаимодействии молекулы скополетина с молекулой пероксида водорода, продуцируемого нейтрофилами.

Для характеристики процесса лектин-индуцированной генерации Н₂О₂ нейтрофилами использовали два параметра:

1. скорость продукции Н₂О₂ – численно равна модулю тангенса максимального угла наклона линейного участка кинетической кривой;

2. длительность лаг-периода продукции Н₂О₂ (зависит от скорости сборки функционально активного НАДФН-оксидазного комплекса в плазматической мембране) – определяется длинной линейного горизонтального участка кинетической кривой от момента добавления в пробу лектина до момента начала спада (тушения флуоресценции).

Следует отметить, что программа регистрации данных на использованном спектрофлуориметре позволяет выводить данные в формате ASCII, однако не обладает возможностью для их первоначальной обработки. В таком виде полученные экспериментальными данными могут быть импортированы в программу Origin (см. рисунок 3.1) для графической визуализации и последующего сохранения проекта в виде рисунка, который может быть вставлен потом в текстовый документ.

Рисунок 3.1 – Графическая визуализация кинетик тушения скополетина в программе Origin

В программе Origin выполняется нормировка полученной кинетики на максимальное экспериментальное значение, чтобы выразить интенсивность сигнала в относительных величинах. Кроме того, оптимальным образом подбираются стили графической визуализации данных (стили, толщины, цвета линий и шрифтов). Для лучшего восприятия графической информации кинетические кривые тушения флуоресценции скополетина в пробах с различным типов нейтрофилов – обработанные и необработанные MβCD –  представляются в одном проекте (на одном рисунке) с использованием нескольких слоев. Это позволяет проследить изменение выбранных характеристических параметров процессов, происходящих в системе при модификации свойств плазматической мембраны нейтрофилов.

Стоит отметить, что для получения достоверных результатов в биофизических исследованиях необходимо проведение серии экспериментов и дальнейшая статистическая обработка результатов. Анализ экспериментальных кривых – аппроксимацию линейного участка и последующую статистическую обработку результатов – также удобно производить при помощи средств Origin (рисунок 3.2).

Рисунок 3.2 – Графическая визуализация кинетик тушения скополетина в программе Origin (аппроксимация линейного участка кинетической кривой)

В ходе экспериментов было обнаружено, что базальный уровень флуоресценции скополетина, находящегося в клеточной среде в отсутствие и в присутствие MbCD, практически не изменялся (рисунок 3.3, кривая 1). При добавлении лектина ConA к суспензии клеток после небольшого промежутка времени (лаг-периода) наблюдалось снижение интенсивности флуоресценции скополетина (рисунок 3.3, кривая 2), свидетельствующее об активации НАДФН-оксидазы и продукции Н₂О₂ лектин-активированными нейтрофилами.

В присутствии MbCD наблюдалось увеличение лаг-периода активации НАДФН-оксидазы ConA-активированных нейтрофилов с последующим более быстрым снижением интенсивности флуоресценции скополетина, свидетельствующим об увеличении продукции Н₂О₂ (рисунок 3.3, кривая 3).

Рисунок 3.3 – Кинетические кривые интенсивности флуоресценции скополетина в суспензии контрольных (1) и ConA-активированных нейтрофилов в отсутствие (2) и в присутствии MβCD (3). Нейтрофилы инкубировали в течение 10 мин при 37°С в присутствии MβCD (10 мМ) до внесения Con A (20 мкг/мл)

При действии почти всех использованных лектинов лаг-период активации НАДФН-оксидазного комплекса обработанных клеток увеличивался по сравнению с аналогичным параметром для необработанных клеток.

При изучении кинетики генерации Н₂О₂ нейтрофилами при действии растительных лектинов было выявлено два различных эффекта влияния экстракции холестерина из мембраны на скорость генерации Н₂О₂. Обработка нейтрофилов MβCD увеличивала скорость окисления скополетина при действии таких лектинов, как САВА, PHA-L, PHA-E, UDA, WGA и Con A (рисунок 3.4A) – т.е. для большинства тестируемых лектинов наблюдался эффект праймирования НАДФН-оксидазной системы обработанных MbCD нейтрофилов. Однако, экстракция холестерина MβCD уменьшала скорость SBA- и SNA-индуцированной генерации пероксида водорода нейтрофилами (рисунок 3.4Б).

Итак, увеличение лаг-периода и увеличение скорости лектин-индуцированной продукции Н₂О₂ нейтрофилами после обработки циклодекстринами свидетельствуют о нарушении динамики сборки НАДФН-оксидазного комплекса в плазматической мембране обедненной холестерином. Не исключено, что ключевую роль в этих процессах играет специфическая кластеризация мембранных гликорецепторов, необходимая для эффективной агрегации клеток [4].

Рисунок 3.4 – Кинетические кривые интенсивности флуоресценции скополетина в суспензии контрольных (1) и PHA-L- (A) и SNA-активированных (Б) нейтрофилов в отсутствие (2) и в присутствии MβCD (3). Нейтрофилы инкубировали в течение 10 мин при 37°С в присутствии MβCD (10 мМ) до внесения лектинов (50 мкг/мл). Измерения проводили при 37°С

3.2 Влияние MβCD на лектин-индуцированную агрегацию нейтрофилов

Турбидометрический метод изучения агрегации, предложенный Борном и О'Брайеном, является в настоящее время наиболее распространенным при исследовании агрегации нейтрофилов. Он основан на регистрации изменений светопропускания суспензии нейтрофилов в буфере.

Для подтверждения участия специфической кластеризации мембранных гликорецепторов в процессе сборки НАДФН-оскидазы было исследовано влияние MbCD на агрегацию нейтрофилов при действии лектина WGA. Специализированное программное обеспечение использованного агрегометра Agr Version 2.01, к сожалению, не обладает необходимыми возможностями для обработки полученных данных, однако позволяет выводить данные в формате ASCII, которые, опять же, в таком виде могут быть импортированы в Origin (см. ранее).

В качестве примера рисунке 3.5 представлена типичная кинетика WGA-индуцированной агрегации нейтрофилов, полученная при помощи  – при добавлении к нейтрофилам лектина WGA наблюдается увеличение светопропускания суспензии клеток (рисунок 3.5А, кривая 1), что свидетельствует об образовании клеточных агрегатов. Методом световой микроскопии показано, что в образцах клеточных суспензий, зафиксированных при максимальной степени агрегации после добавления WGA, практически все клетки находились в агрегированном состоянии (рисунок 3.5В). После обработки клеток MbCD степень WGA-индуцированной агрегации нейтрофилов снижается по сравнению с контролем (рисунок 3.5А, кривая 2). На фотографиях суспензий видно, что обработка клеток MbCD при WGA-индуцированной агрегации приводила к уменьшению размеров агрегатов нейтрофилов и увеличению доли единичных, не находящихся в агрегатах клеток (рисунок 3.5Г). 

А	80 µm Б
80 µm В	80 µm Г

Рисунок 3.5 – Микроскопический анализ WGA-индуцированных агрегатов нейтрофилов после обработки МβCD. А – кинетические кривые WGA-индуцированной агрегации нейтрофилов в отсутствие (1) и присутствие (2) MβCD. Б – одиночные клетки; В – агрегаты, образованные при добавлении WGA (7,5 мкг/мл) к суспензии нейтрофилов в PBS; Г – агрегаты, образованные после добавления WGA к суспензии нейтрофилов, предварительно инкубированной в течение 10 мин при 37°С в присутствии MβCD (10 мМ)

При исследовании стабильности WGA-агрегатов нейтрофилов было выявлено уменьшение степени GlcNAc-индуцированной дезагрегации нейтрофилов с пониженным содержанием холестерина (см. рисунок 2.2, кривая 2). Так, параметр стабильности WGA-индуцированных агрегатов интактных нейтрофилов составлял 85 ± 4%, в то время как этот же параметр для нейтрофилов, предварительно обработанных MbCD, достоверно увеличивался и составлял 97 ± 3% (P<0,05, n=7). Таким образом, у нейтрофилов с пониженным содержанием мембранного холестерина были достоверно снижены степень и скорость WGA-индуцированной агрегации, в то время как параметр стабильности R WGA-агрегатов нейтрофилов увеличивался.

Заключение

В представленной работе показано, что проведение биофизических исследований на современном уровне невозможно без использования информационных технологий на каждом из этапов исследований.

В работе был проведен анализ методик биофизических исследований, а именно – изучение процесса активации НАДФН-оксидазны и количественная характеристика процесса генерации пероксида водорода нейтрофилами (оценка лаг-периода сборки НАДФН-оксидазного комплекса и скорость генерации Н₂O₂), исследование процессов агрегации и дезагрегации клеток, а также средств обработки полученных результатов.

Произведение расчетов требует вдумчивого подхода к выбору вычислительных сред, поскольку для выполнения относительно несложной обработки больших массив данных лучше использовать специально созданные для этого программы (например, Origin®). В то время как мощные вычислительные системы (Mathematica, MatLab) могут увеличивать временные затраты на проведение вычислений без улучшения выходных результатов, однако позволяет создавать собственные алгоритмы расчета прикладных параметров исследуемых структур. В каждом конкретном примере исследования зачастую необходимо применение широкого спектра средств ИТ.

Программное обеспечение аппаратного исследовательского комплекса в ряде случаев требует интеграции в общий программный комплекс, поскольку в настоящее время одной из проблем использования спектра приборов требует как знаний по использованию программных продуктов приборов, так и часто ограничивает возможности применения результатов проведенных измерений.

Список литературы к реферату

1. Лакович Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии // Пер. с англ. М., 1986. – 453 с.

2. Поликарпов, В.М. Современные методы компьютерной обработки экспериментальных данных: учебное пособие / В.М. Поликарпов, И.В. Ушаков, Ю.М. Головин. – Тамбов: Изд-во Тамб. гос. техн. ун-та, 2006. – 84 с.

3. Горудко, И.В. Лектин-индуцированное образование межклеточных контактов, устойчивых к действию гаптенных углеводов, и внутриклеточная сигнализация: дис.... канд. биол. наук: 03.00.02 / И.В. Горудко – Мн., 2001. – 173 с.

4. Тимошенко, А.В. Кластеры мембранных рецепторов и их движение в клетках / А.В. Тимошенко, С.Н. Черенкевич // Успехи совр. биол. – 1990. – Т. 109, Вып. 2. – С. 206 – 218.