Существуют различные способы разделения связанного с антителами и свободного гормона. В системах для полипептидных гормонов обычно применяют «методику вторых антител». Поскольку исходный комплекс гормона с антителом растворим, с помощью простого центрифугирования разделить связанный и свободный гормон невозможно. В связи с этим после достижения равновесия между гормоном и первыми антителами добавляют вторые антитела, полученные на g-глобулин животного того вида, у которого получали первые антитела. Поскольку вторые антитела будут теперь связывать образовавшийся комплекс между гормоном и первыми антителами, то возникнет вторичный нерастворимый молекулярный комплекс, и связанный свободный гормон можно будет отделить простым центрифугированием. Например, если антитела к гастрину вырабатывались у кролика, то вторые антитела к кроличьему g-глобулину следовало бы получать у животного другого вида (лошади, овцы или козы). Лошадиный антикроличий глобулин нужно было бы добавить в пробирку для анализа после установления равновесия в реакционной смеси, содержащей меченный 125I гастрин и кроличью антигастриновую сыворотку. Время, необходимое для установления равновесия реакции со вторыми антителами, зависит от концентрации кроличьей сыворотки-носителя в реакционной смеси. Например, если первые антитела к гастрину получены от кролика, в пробирку для анализа можно дополнительно добавить кроличью сыворотку-носитель или глобулин. Если кроличья сыворотка-носитель занимает 2% объема пробирки, то для осаждения кроличьего g-глобулина следует добавлять относительно большой объем вторых антител (0,05—0,2 мл). Поскольку равновесие достигается за время, определяемое первым законом действующих масс, то оно должно достигаться относительно быстро (за несколько часов). Это время вначале находят эмпирически и подбирают необходимый наименьший оптимальный объем вторых антител для каждой их партии, получаемой в лаборатории или от торговых фирм. В пробирки для анализа можно добавлять меньшие концентрации сыворотки- носителя, что уменьшит необходимый объем вторых антител, но увеличит время, требуемое для достижения равновесия реакции с их участием.
|
|
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТЕРОИДОВ
Стероидные гормоны обычно содержатся в сыворотке в связанном с различными белками виде. Поскольку сывороточные белки могут обладать сродством к гормону, сходным со сродством антител, используемых в радиоиммунологическом анализе, то чтобы последний дал надежные результаты, гормоны нужно сначала экстрагировать, т. е. отделить от сывороточных белков. До широкого распространения радиоиммунологических методов кортизол и другие сходные стероиды, которые ассоциируются с кортизолсвязывающим глобулином (КСГ), определяли методами конкурентного белкового связывания, в которых использовали этот белок-переносчик. В настоящее время такой подход применяют реже, поскольку при этом приходится характеризовать каждую партию сыворотки, из которой извлекают КСГ, и требуется более детальное разделение стероидов с помощью тонкослойной хроматографии. Необходимость всех этих начальных этапов исследования, требующих дополнительного времени, а также более широкий разброс результатов от анализа к анализу отодвинул данный метод на второй план по отношению к радиоиммунологическому.
|
|
Наиболее распространенным средством разделения связанных с антителами и свободных стероидных гормонов является покрытый декстраном уголь. Он адсорбирует стероиды, не связанные с антителами, и переводит их в осадок. Растворимый же комплекс гормон—антитело остается в супернатанте. В системах определения стероидов, в которых используется гормон, меченный тритием, супернатант можно декантировать в сосуд, содержащий жидкий сцинтиллятор. В некоторых системах определения стероидных гормонов используют меченые тирозилированные стероиды. В этих случаях разделение связанного и свободного гормона проводят обычно методом двойных антител.