Специфичность системы определения

Следует учитывать как структуру, так и степень очистки гормо­на, используемого для иммунизации. Гликопротеиновые гормоны человека (ЛГ, ФСГ и ТТГ), а также хорионический гонадотропин, имеют общую четвертичную структуру и состоят из двух различ­ных субъединиц, обозначаемых как a и бета [42]; a-субъединица, по существу, совершенно одинакова во всех этих гормонах с точки зрения ее аминокислотной последовательности. Иммунологическую и биологическую специфичность этим гормонам придает b-субъ­единица. В связи с этим необходимо тщательно выбирать антисы­воротку, полученную к любому из гликопротеиновых гормонов, и тщательно проверять, достаточно ли она специфична, чтобы мож­но было определить концентрацию данного гормона в присутствии в той же пробе высокого уровня других гликопротеиновых гормо­нов. В некоторых случаях перекрестной реакции, обусловленной общностью антигенных детерминант, можно избежать, адсорбируя антитела на общем антигене. Например, если антисыворотка к ТТГ обнаруживает перекрестную реакцию с ФСГ и ЛГ и эта перекрест­ная реакция обусловлена общими детерминантами a-субъединицы, то данную антисыворотку можно очистить с помощью свободной a-субъединицы или ХГЧ, который содержит a-детерминанты. Такая «очищенная» антисыворотка в идеальном варианте специ­фична по отношению к ТТГ и практически не менее чувствительна к этому гормону.

Проблема еще больше усложняется в связи с тем, что b-субъ­единицы ХГЧ и ЛГ обладают выраженной структурной гомологи­ей, что и делает биологическую активность этих двух молекул неотличимой. В результате антитела, образующиеся к целым моле­кулам ЛГ и ХГЧ, по всей вероятности, будут взаимодействовать с любой из них и обоими вместе. Поскольку некоторые опухоли экто­пически секретируют ХГЧ и поскольку высокие концентрации ХГЧ присутствуют и в нормальных условиях при беременности, при обычном определении ЛГ должны получать завышенные ре­зультаты, трактовать которые нужно с большой осторожностью. Наилучшим клиническим доказательством преимущественного присутствия в периферической крови ХГЧ, а не ЛГ, является рез­кое расхождение концентраций ЛГ и ФСГ в одной и той же пробе; Загрязнение гормонального препарата, используемого для им­мунизации животного, другим гормоном может создавать и другие методические проблемы. Даже в высокоочищенных препаратах гормонов гипофиза человека присутствуют небольшие, но сущест­венные примеси других гипофизарных гормонов. Это справедливо также для гормонов, получаемых в чистом виде из поджелудочной железы и желудочно-кишечного тракта. Очевидно, что у иммуни­зированного этими гормонами животного могут образовываться антитела к любому из попавших в его организм гормонов, в том числе и к тем, которые присутствовали в виде примесей, В связи с этим необходимо знать источник гормона, поскольку в процессе его очистки могут одновременно очищаться и другие гормоны, попадающие в конечный препарат. В идеальном случае следовало бы проверить структурное сходство гормонов, так как именно оно может служить основой перекрестной реактивности некоторых ан­тисывороток по отношению к разным гормонам.

ЭФФЕКТ СЫВОРОТОЧНЫХ БЕЛКОВ

Поскольку между различными стероидами, между тироксином и трийодтиронином и некоторыми их метаболитами и между различ­ными формами витамина D отмечается выраженная структурная гомология, не всегда возможно получить антисыворотку, доста­точно специфическую, чтобы без предварительного применения методов экстракции и разделения избирательно определять эти гормоны и их метаболиты. Некоторые гормоны циркулируют в кро­ви, будучи связанными со специфическими белками-переносчика­ми или более рыхлой связью с альбумином. Для того чтобы избе­жать загрязнения радиоиммунологической системы связывающими белками сыворотки, необходимо вначале экстрагировать гормон соответствующим растворителем. Начальную экстракцию следует проводить и при малой специфичности антител к гормону. В неко­торых случаях может оказаться достаточной дифференциальная экстракция, но в других необходимо произвести хроматографическое разделение гормонов. К наиболее распространенным средст­вам разделения структурно близких стероидов относятся тонко­слойная хроматография и хроматография на колонках сефадекса LH-20. Поскольку крупные полипептидные гормоны циркулируют в крови, не будучи связанными с белками-переносчиками, началь­ный этап экстракции в этом случае не нужен, и аликвоту сыворот­ки можно прямо помещать в пробирку для анализа. Однако содер­жащиеся в сыворотке протеазы могут обусловить занижение кон­центрации некоторых полипептидных гормонов. Если разрушение гормона существенно изменяет его структуру, он может и не реа­гировать с антителами. В результате появляется необходимость добавления в пробу ингибиторов ферментов, чтобы противодейст­вовать эффекту протеаз. К ингибиторам протеаз, добавляемых в сосуды с пробами на АКТГ, глюкагон и другие гормоны, которые могут подвергаться быстрой протеолитической деградации, отно­сятся трасилол и бензамидин.

В отношении некоторых полипептидных гормонов отмечаются неспецифические эффекты сывороточных белков. Эти неспецифи­ческие белковые эффекты можно нивелировать, добавляя пустую сыворотку в пробирки для исследования, не содержащие сыворот­ки, с тем, чтобы все пробирки содержали сравнимые концентрации мешающих определению сывороточных белков. Каждую антисыворотку можно эмпирически проверять на неспецифический эффект белка в отношении реакции антиген—антитело.