Метод определения активности пероксидаз в органах растений

При окислении в организмах кислородом органических субстратов в качестве основных продуктов образуются пероксид водорода (Н2O2) или органические пероксиды, которые могут окислять различные вещества. Одним из хорошо известных ферментов, способных катализировать реакции пероксидного окисления химических веществ в живых клетках, является пероксидаза, которая с пероксидом водорода образует комплексное соединение, в результате чего пероксид переходит в активированное состояние, превращаясь в акцептор водорода.

Растительные пероксидазы - двухкомпонентные ферменты, локализованные главным образом в пероксисомах. В состав каталитического центра этих ферментов входит протогем. Действие пероксидазы можно представить в виде следующей реакции:

Субстрат−Н₂+ Н₂O₂ →окисленный субстрат + 2Н₂O

Пероксидазы катализируют окисление пероксидом водорода фенольных соединений, жирных кислот, аминокислот и аминов, терпенов, восстановленного глютатиона. Эти ферменты обладают высокой термоустойчивостью, поэтому после стерилизации растительной продукции тепловой обработкой для последующего хранения и переработки в ней контролируется активность пероксидаз. При ферментации чая и табака пероксидазы наряду с полифенолоксидазами участвуют в образовании окрашенных и ароматизирующих веществ в составе этих продуктов.

Принцип метода. Определение активности пероксидаз в растительной продукции основано на проведении ферментативной реакции окисления пирогаллола пероксидом водорода с образованием окрашенного соединения пурпурогаллина, количество которого оценивают колориметрированием на фотоэлекгроколориметре.

Оборудование. Ступки фарфоровые с пестиками диаметром 8-10 см или гомогенизатор; марля для фильтрования; чашки фарфоровые диаметром 6-8 см; колбы конические на 50 мл; дозирующие пипетки на 1-10 см; дозирующее устройство на 5 мл для раствора серной кислоты; мерные колбы на 100 мл и на 1 л с пробками; темная склянка для раствора пероксида водорода; термостат, фотоэлектроколориметр.

Реактивы. Дистиллированная вода (свободная от диоксида углерода);

концентрированный раствор пероксида водорода; концентрированная

серная кислота; 0,05 М фосфатный буфер (рН=7,0); пирогаллол.

Приготовление растворов. 1% раствор пероксида водорода: готовится

свежий раствор перед каждым анализом путем разбавления концентрированного раствора в мерной колбе на 100 мл. Приготовленный раствор переливают в темную склянку. 10% раствор серной кислоты: в фарфоровый стакан на 500 мл наливают 300 мл дистиллированной воды, к шторой с помощью дозирующего устройства приливают 60,6 мл концентрированной серной кислоты, полученную смесь перемешивают и после охлаждения переливают в мерную колбу на 1 л, ополаскивая стакан дистиллированной водой. Затем объем раствора в колбе доводят водой до метки и перемешивают. 0,05 М фосфатный буфер (рН=7,0): в мерной колбе на I л дистиллированной водой растворяют 17,911 г Na2HPO4 −12H2O; в мерной колбе на 500 мл дистиллированной водой растворяют 3,901 г NaH2PO4∙H2O. Затем 390 мл раствора NaHPO4∙12H2O; смешивают с 610 мл раствора Na2HPO4 12H2O. 1% раствор пирогаллола: 5 г пирогаллола растворяют дистиллированной водой в мерной колбе на 500 мл.

Ход определения. Навеску растительного материала 2 г (клубни

картофеля, корнеплоды, проростки семян злаковых, зернобобовых, масличных культур, овощи, плоды и ягоды, вегетативная масса растений)

взвешивают на лабораторных весах с точностью до 0,01 г и растирают в ступке или измельчают в гомогенизаторе до получения однородной массы. В случае необходимости в ступку для лучшего растирания растительного материала добавляют небольшое количество чистого кварцевого песка. К измельченному в ступке материалу приливают дозирующей пипеткой 20 мл 0,05 М фосфатного буфера (рН=7,0) для экстракции ферментного белка и полученную смесь интенсивно перемешивают пестиком в течение 15 минут. Затем в фарфоровую чашку помещают уложенную в 4 слоя марлю и на нее переносят измельченный растительный материал из ступки, заворачивают края марлевой ткани и отжимают через 4 слоя марли растительный экстракт с растворенным ферментным белком в коническую колбу на 50 мл.

В ходе последующего анализа в 2 конические колбы на 50 мл дозирующей пипеткой вносят по 4 мл ферментного экстракта и в одну из колб для инактивации ферментного белка (контроль) с помощью дозирующего устройства приливают 5 мл 10% раствора серной кислоты, смесь перемешивают. После этого в обе колбы дозирующей пипеткой приливают по 5 мл 1% раствора пирогаллола и по 1 мл 1% раствора пероксида водорода, смеси перемешивают и помещают на 15 минут в термостатированную камеру при температуре 25°С.

Реакция проводится в отсутствии света, который активирует самопроизвольный распад пероксида водорода на кислород и воду. Отсчет времени ферментативной реакции начинается в тот момент, когда к ферментному раствору приливается раствор пероксида водорода. По истечении 15 минут теперь уже в колбу с активным ферментом для его инактивации приливается 5 мл 10% раствора серной кислоты и в этот момент фиксируется точное время колориметрируют на фотоэлекгроколориметре с использованием прекращения ферментативной реакции. После проведения ферментативной реакции окрашенные растворы образующимся под действием пероксидаз пурпурогаллином зеленого светофильтра при толщине фотометрируемого слоя 5 мм.

Обработка и оценка результатов. Активность пероксидаз рассчитывают

по формуле:

A= 20