Внутрклеточный транспорт холестерина

Обмен холестерина между органеллами в клетке идет с достаточно большой скоростью (период полуобмена зависит от типа мембран и составляет 1—2 ч). В супернатанте печеночных клеток были найдены белки, способные эффективно связывать холестерин и, по-видимому, участвовать в его транспорте. Это так называемые холестерин-транспортные факторы, холестерин-связывающие белки, стерин-переносящие белки. Несмотря на то что эти белки обнаружены довольно давно, механизмы, с помощью которых они осуществляют внутриклеточный транспорт холестерина «in vivo» и поддерживают неравномерное содержание этого липида

в различных мембранах, неясны. Транспорт холестерина в мито­хондриях в ходе стероидогенеза ингибируется цитохалазином В и  винбластином, что позволяет предположить участие в этом процессе цитоскелета.

Транспорт холестерина от эндоплазматического ретикулума к плазматической мембране был детально исследован с помощью меченого холестерина методом быстрого выделения мембранных структур. Объектом в этих работах служили яйцеклетки китайского хомячка. Было показано, что при 37° С вновь синтезированный меченый холестерин появляется в плазматичес-кой мембране уже через 10 мин после обнаружения меченого стерина в интакт- ной клетке. Транспорт холестерина блокировался довольно большими концент-рациями энергетических ядов KCN и KF. При этом цитохалазин В, колхицин, лонексин и циклогексимид не влияли на перенос холестерина, что позволило авторам исключить из этого транспортного процесса аппарат Гольджи и цито-скелет. Тем не менее в транспортных цистернах аппарата Гольджи (на роли ап-парата Гольджи во внутриклеточном транспорте мы подробно остановимся ниже) обнаружено высокое содержание холестерина, что ставит под сомнение исключение этих структур из транспортных систем холестерина внутри клетки.

2.3. ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЙ ТРАНСПОРТ ФОСФОЛИПИДОВ

Спонтанный транспорт фосфолипидов между различными органеллами — очень медленный процесс с полупериодом около 12 ч. Возможно, он имеет физиологическое значение при биогенезе- биомембран. В то же время транс-порт вновь синтезированных фосфолипидов в митохондрии из эндоплаз-матического ретикулума в клетках печени крыс осуществляется в течение нес-кольких минут. Из цитозоля клеток печени были получены белки, способные осуществлять перенос фосфолипидов между органеллами в опытах in vitro, но неизвестно, как эти процессы протекают в клетке in vivo.

Везикулярный механизм транспорта фосфолипидов между органеллами и цитоплазматической мембраной был доказан для одноклеточных (Acanthamaeba palestinensis и Dictyostelium disco- ideum). В клетках высших животных он, по-видимому, тоже может иметь место. Однако транспорт вновь синтезированного фосфатидилэтаноламина в клетках фибробластов китайских хомячков не блоки-ровался энергетическими ядрами, веществами, разрушающими цитоскелет, а также агентами, нарушающими функционирование аппарата Гольджи.

Вновь синтезированный фосфатидилэтаноламин появляется практически сразу после введения в клетку ³Н-этаноламина или других предшественников синтеза этого фосфолипида. Таким образом, как транспорт фосфатидилэтаноламина к плазматической

мембране, так и его траксмембранный перенос — очень быстрые процессы, в которых, по-видимому, участвуют белки-переносчики.

В настоящее время выделен и полностью очищен ряд белков, обладающих специфичностью к определенным классам фосфолипидов и ускоряющих перенос или обмен фосфолипидов между органеллами в опытах in vitro. К этим белкам относятся фосфатидилхолин — специфический транспор-тирующий белок, полученный из печени быка и из печени крыс, цереброзид — транспортирующий белок, а также неспецифический транспортирующий белок печени. Несмотря на то что для некоторых транспортирующих белков выяснена структура связывающего липид активного центра, механизм функционирования этих белков in vivo остается неясным.

Фосфолипиды клеточных мембранных структур обновляются очень быстро. Почти половина всех фосфолипидов обновляется в ходе каждого деления клетки. При этом скорость деградации и синтеза фосфолипидов зависит от типа мембранных структур и от класса фосфолипида. Полупериод жизни клеток печени составляет 2—3 дня. Половина всех фосфолипидов внешней мембраны митохондрий обновляется через 5—6 дней, внутренней — че­рез 8—10, а фосфолипиды мембран микросом — через 1—2 дня. При этом полупериод обмена сфингомиелина — 38 ч, фосфатидилсерина — 23, фосфати-дилхолина и фосфатидиламина — около 15 ч. Наиболее быстро происходит в клетке обмен фосфоинозити- дов, что в первую очередь связано с их участием в трансмембранной передаче сигнала (см. гл. VI). Как же липиды покидают мембраны? По-видимому, один из способов удаления липидов — активация эндогенных фосфолипаз. Определенную роль в процессе деструкции липидов играет и их перекисное окисление.

Фосфолипиды плазматической мембраны могут обновляться и в результате эндоцитоза с последующим разрушением в лизосомах. Этот путь достаточно убедительно доказан для сфингомиелина плазматической мембраны фибробластов.

Метаболизм мембранных фосфолипидов в ходе биогенеза биологических мембран играет важную роль как в норме, так и при развитии ряда патоло-гических процессов. Некоторые лекарства, яды модифицируют фосфолипидный состав биологических мембран, нарушают ход биогенеза. Особую роль обмен мембранных липидов играет в адаптации холоднокровных животных к темпе­ратуре окружающей среды. Так, например, ненасыщенность жирных кислот мембранных фосфолипидов рыб резко возрастает при переходе рыб из более теплой воды в холодную, а также при изменении характера и интенсивности двигательной активности.

В настоящее время мы не знаем всех механизмов, регулирующих метаболизм обмена липидов в ходе биогенеза биологических мембран. Однако кроме транспортных процессов важную роль в биогенезе мембран играют регуляция активности эндогенных фосфолипаз и процессы перекисного окисления липидов.

 

 

2.4. ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЙ ТРАНСПОРТ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ

В ходе биогенеза биомембран синтезированные в рибосомах шероховатого эндоплазматического ретикулума белки транспор­тируются к различным органеллам клетки, к плазматической мембране. Высокая

 

специфичность «доставки» белков к определенным мембранным структурам осуществляется цистернами аппарата Гольджи. Цистерны аппарата Гольджи организованы в стопки (рис. 63), при этом в типичных клетках млекопитающих

в стопке, как правило, 5—6 цистерн, в клетках низших организмов и растений — 20 и более цистерн.

В аппарате Гольджи, как правило, довольно высока плотность мембранных белков, пронизывающих липидный бислой. До тех пор пока клетка не начнет делиться, цистерны аппарата Гольджи плотно упакованы и имеют уплощенную форму. До сих пор не ясны механизмы, отвечающие за уплощенную форму цистерн и обеспечивающие их характерную упаковку.

Стопка Гольджи ориентирована в клетке строго определенным образом и имеет две функционально различные поверхности. На одном конце стопки цистерны специализированы для приема везикул, содержащих вновь синтезированные гликопротеины. Это так называемая цис- поверхность стопки. В ходе синтеза на внешней поверхности эндоплазматического ретикулума белок либо проникает внутрь просвета сети ретикулума, либо встраивается в его мембрану. Этот процесс зависит от типа белка. После того, как сборка белка закончена, часть мембраны эндоплазматического ретикулума с вновь синтезированными белками выпячивается, образует везикулу, которая транспортируется к цис -поверхности аппарата Гольджи и сливается с ней (см. рис. 63). Это первый этап транспорта белка через систему аппарата Гольджи. Белок, претерпевая ряд превращений, начинает движение к транс-поверхности аппарата Гольджи и затем покидает его в составе липидной везикулы.

Эти структуры были открыты в 1898 г. итальянским гистологом Камилло Гольджи. Вскоре после этого было выдвинуто предположение, что в секреторных клетках эти органеллы участвуют в секреции белков, транспортируя их к поверхности клетки. Однако экспериментальные доказательства транспорта секреторных белков через аппарат Гольджи были получены только в 1960 г. Дж. Палладе из Рокфеллеровского института медицинских исследований в США. Дж. Палладе с группой коллег проследил путь белков в клетках поджелудочной железы от эндоплазматического ретикулума до секреторных гранул, покидающих клетки поджелудочной железы. Работа была выполнена с помощью комбинации радиоавто-графического анализа, цитохимии и электронной микроскопии. Прохождение белков через аппарат Гольджи сопровождается присоединением к ним молекул сахаров.

Дальнейший успех в изучении аппарата Гольджи был связан с развитием методов дифференциального центрифугирования. В 1970—1980 гг. был выполнен цикл работ, позволивший получить высокоочищенные мембраны ап-парата Гольджи и разделить их по плотности цистерн на три фракции. Было продемонстрировано, что в аппарате Гольджи происходят не только гликозили- рование и отщепление от белков определенных молекул сахаров, но и фосфо-рилирование белков, присоединение к ним сульфатных групп и даже жирных кислот. Это «созревание» белков в аппарате Гольджи, получившее название процессинг, очевидно, необходимо для их сортировки и направленного транс-порта. В настоящее время ясно, что процессингу подвергаются не только секре­торные белки, но и другие белки, синтезирующиеся в клетке и включающиеся в биогенез клеточных мембран.

2.5. СБОРКА МУЛЬТИСУБЪЕДИНИЧНЫХ КОМПЛЕКСОВ И ОБНОВЛЕНИЕ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ

После встраивания мембранного полипептида в мембрану он еще должен приобрести правильную конформацию, обеспечивающую его биологическую активность, а если речь идет о мультнсубъединичных комплексах, то связаться с другими белками. В частности, у эукариот при этом должны произойти различные ковалент-ные модификации, например гликозилирование, ацилирование, сульфирование или образование днсульфидных связей. Даже когда такие модификации не являются необходимыми, процесс конформацион-ного созревания может быть медленным и отстоять по времени от встраивания в мембрану.

Например, у Е. coli четко наблюдается сборка стабильных три-меров обоих белков, LamB и OmpF, после включения соответствующих мономеров в наружную мембрану, при этом созревание LamB занимает около 5 мин. В эукариотнческих клетках гли-копротеин гемагглютннииа вируса гриппа, прежде чем попасть из эндоплазматического ретикулума в комплекс Гольджи, должен сформировать правильную четвертичную структуру, соответствующую зрелой форме. Несвериутые молекулы гемагглютинина остаются в эндоплазматическом ретикулуме. Образование тримеров занимает примерно 7—10 мии. Сходная олигомеризация наблюдается также для G-белка вируса везикулярного стоматита.

Сборка многих мультисубъединичных комплексов, содержащих разные субъединицы, тоже, по-видимому, происходит в эндоплазматическом ретикулуме. Примером служит никотиновый ацетилхо-линовый рецептор, который содержит две а-субъединицы и по одной /3-, у- и б-субъединице. С помощью антител можно различить отдельные формы а-субъединицы: 1) начальный продукт, встраивающийся в эндоплазматический ретикулум; эта форма не может связывать антагонист а-бунгаротоксин; 2) форма, способная связываться с а-бунгаротоксином и образующаяся через несколько минут после завершения трансляции в эндоплазматическом ретикулуме; 3) зрелый рецептор, содержащий все субъединицы, который обнаруживается через 15 мин после завершения трансляции в эндоплазматическом ретикулуме; 4) готовый рецептор на клеточной поверхности, появляющийся спустя примерно 2 ч после трансляции. Созревание включает образование днсульфидных связей, олигосахаридный процессинг и ацилирование при участии жирных кислот. Вероятно, определенную роль в сборке, происходящей в комплексе Гольджи, играет фосфорилирование субъединиц.

Решающим фактором процесса сборки является, вероятно, стабильность таких стехиометрических комплексов, как ацетилхолино-вый рецептор. По-видимому, в некоторых системах отдельные субъединицы синтезируются в значительном избытке и не образуют стабильных комплексов, а подвергаются протеолитическому расщеплению. Об этом свидетельствуют результаты, полученные при изучении некоторых мультисубъедииичных комплексов, в частности Т-клеточного рецептора антигена.

Изучался также процесс созревания и сборки структуры, образующей Na-канал. Необходимым условием созревания является образование дисульфидной связи между а- и /Зг-субъединицами, однако это событие происходит спустя примерно 1 ч после трансляции и транспорта субъединиц в аппарат Гольджи, а рецептор появляется на клеточной поверхности чере:> 4 ч после трансляции. В этом случае свободные а-субъединнцы не подвергаются быстрой деградации, а сохраняются в межклеточном пуле и, возможно, используются в дальнейшем в качестве предшественников для формирования канала в растущих нейронах.

Созревшие мембранные белки подвергаются непрерывному обновлению. Период полуобновления Na-канала составляет около 30 ч, что типично для поверхностных белков. Обновление большой субъединицы Na/K-АТРазы в растущих клетках в культуре происходит за время 20 — 40 ч. По-видимому, деградация по крайней мере некоторых белков происходит в лизосомах. В качестве примера можно привести цитохром Р450, содержащийся в Э.Р