Практическая работа студентов

 Работа 1. Освоение метода авторадиографии

 Метод авторадиографии представляет собой способ фотографической регистрации излучения радиоактивных веществ, оказавшихся в тканях и клетках живых организмов. Он сочетает в себе принципы морфологического и биохимического анализов с принципами научной фотографии.

В авторадиогрфии используется процесс радиоактивного распада, состоящий в перегруппировке нейтронов и протонов и сопровождающийся испусканием α-, β-, γ-лучей. Наибольшее распространение в цитологических исследованиях получили искусственные изотопы с мягким β-излучением. Относительно небольшая энергия β-частиц и их слабая проникающая способность создают благоприятные условия для регистрации следов пробега этих частиц в фотографических эмульсиях. К числу искусственных изотопов с β-излучением относятся такие изотопы как ³H, ¹⁴C, ³⁵S, ³²P, ⁵⁹Fe, ¹³¹I и др., т.е. изотопы элементов, входящих в состав либо всех органических соединений (водород, углерод), либо в состав отдельных структурных или биологически активных соединений (серосодержащие белки, сульфомукополисахариды, гормоны, гемоглобин и др.)

Возможность регистрации траекторий β-частиц в эмульсии основана на способности электронов при прохождении через эмульсию вызывать ионизацию и освобождение электронов в ионной решетке кристаллов AgBr. Такая ионизация создает условия для образования скрытого изображения. Сущность этого процесса состоит в том, что свободные электроны, возникшие в результате воздействия частицы на кристалл AgBr, перемещаются к центрам чувствительности. Взаимодействие ионов серебра с электронами в центрах чувствительности приводит к образованию здесь зародышей кристаллов металлического серебра. Проявитель (восстановитель, снабжающий кристаллы электронами) вызывает восстановление зерен, содержащих скрытое изображение, в металлическое серебро, что и обусловливает почернение эмульсии. В современной авторадиографии применяются в основном ядерные эмульсии, специально предназначенные для регистрации α- и β-излучения.

Необходимо помнить, что большое значение при анализе субстрата включения имеет правильный выбор меченого предшественника, который должен обладать избирательностью включения в естественные процессы внутриклеточного метаболизма исследуемого соединения. В настоящее время синтезированы меченые предшественники, обладающие высокой избирательностью включения в нуклеиновые кислоты, белки и другие соединения. Наиболее широко применяется тимидин, меченный по тритию.

Тритий (³Н) – единственный радиоактивный изотоп водорода. Период его полураспада (Т ½) 12,5 лет. Возникающие при распаде β-частицы обладают малой энергией –18 кэВ, длина пробега в фотоэмульсии составляет 1-2 мкм (длина пробега электрона в веществе прямо пропорциональна квадрату его энергии и обратно пропорциональна плотности вещества). Тимидин, меченный по тритию, – соединение, используемое ядром для синтеза ДНК в период его редупликации. Включение меченого тимидина в естественные процессы синтеза ДНК происходит на его последних этапах. Экзогенный тимидин в организме сохраняется лишь в течение 1 часа. Благодаря этому обеспечивается импульсный характер включения.

Недостатком ³Н-тимидина является возможный радиационный эффект в связи с локализацией его в хромосомах и большой чувствительностью последних к облучению.

Приготовление автографа

Тимидин, меченный по тритию, вводится животному (подкожно) из расчета 18,5 мБк на 1 г массы животного (мыши). Через 60 мин после введения препарата мышь забивают методом декапитации. Затем трубчатые кости, грудину освобождают от мышц и ножницами отсекают. Из них шприцем набирают костный мозг и готовят мазки, разбавив его сывороткой крови, оставшейся в кювете после декапитации животного. Приготовленные мазки подсушивают и фиксируют в метиловом спирте в течение 3 мин, затем обезжиривают, погружая мазки трижды по 3 мин в стаканчики с этиловым спиртом (96˚). После этого в фотокомнате при зеленом светофильтре наносится фотоэмульсия (источник света должен быть расположен на расстоянии 90 см от манипуляционного стола).

После экспозиции (1-3 недели) мазки помещают в подставки и проявляют в течение 6 мин в мягкодействующем проявителе, затем быстро промывают в воде и переносят в кислый фиксатор на 10-минутную фиксацию. Следующий этап: препараты помещают в ванночку и в течение 10-15 мин промывают в проточной воде. Температура проявляющего раствора должна быть 19˚С, что предотвращает отделение эмульсии от мазков. После отмывания препараты сушат на воздухе, затем окрашивают азурII-эозином (на 6 частей воды 1 часть азура и 0,5 эозина) в течение 7 мин и вновь осторожно промывают и сушат на воздухе. Эмульсия подсыхает, и мазки можно исследовать под микроскопом. Положительные автографы определяют по наличию небольших черных зерен (величина 0,5 – 1 М) над клетками.

Приготовление проявителя и закрепителя в авторадиографических исследованиях

На 1000 мл дистиллированной воды:

Проявитель: 1. Амидол – 3 г

                2. Сульфит натрия – 10 г

                3. Лимонная кислота – 0,4-0,5 г

Закрепитель: 1. Гипосульфит – 400 г