Определение активности ферментов

О скорости ферментативной реакции судят или по скорости убыли субстрата, или по скорости образования продукта. За единицу активности любого фермента (Е) принимают то количество фермента, которое в оптимальных условиях катализирует превращение 1мкмоля субстрата в 1мин. Существует и другая еденица активности:

1 катал - количество Е, которое катализирует превращение 1моль субстрата в 1 сек.

1 Е фермента = 16,67 нкатал.

Для выражения активности фермента используется определение удельной и молекулярной активности. Удельная активность - число Е ферменттивной активности в расчёте на 1мг белка. Чем выше степенб очистки фермента, тем выше удельная активность. Число оборотов фермента (молекулярная активность) - число молекул субстрата, подвергающихся превращению одной молекулой фермента в 1 мин. Число оборотов широко варьирует, например:

1) Карбонгидраза (катализирует перенос Н₂СО₃) совершает 36000000 оборотов /мин

2) Каталаза (Н₂О₂ ---- О₂ + 2Н₂О₂) совершает 4000 оборотов / мин

3) Фосфоглюкомутаза – 1240 оборотов / мин

Для качественного обнаружения и количественного определения активности сложных ферментов используют следующие методы:

ЛДГ

Лактат ---------- ПВК

НАД НАД*Н₂ + Н

НАД*Н₂ интенсивно поглощает свет. По излучению ПВК можно судить о НАД*Н₂. На 1 молекулу лактата образуется 1 молекула НАД*Н₂.

НАД*Н₂ интенсивно флюоресцирует. Интенсивность флюоресценции будет пропорциональна концентрации.

10. ЛОКАЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ В КЛЕТКЕ, МАРКЁРНЫЕ И ОРГАНОСПЕЦИФИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ.

Все ферменты и метаболиеские процессы компартментализованы (раздельны и изолированы). В нормальной клетке находится около 1000 ферментов. Упорядоченное взаимодействие ферментов достигается путём многоуровневой регуляции и компартментализации. Зная локализацию ферментов в клетке и определяя их активность в крови, можно судить о степени деструкции ткани.

Ядро: локализованы РНК – полимеразы, НАД – синтетаза, ферменты, участвующие в репликации ДНК.

Митохондрии: ферменты тканевого дыхания, окислительного фосфорилирования, ферменты в- окисления жирных кислот, цикла Кребса, синтеза мочевины.

Лизосомы: гидролитические ферменты с оптимумом рН в области 5 (пептиды, эстеразы).

Рибосомы: ферменты белкового синтеза.

ЭПС: ферменты синтеза липидов, ферменты гидроксилирования, ферменты детоксикации (мети –

лирования, ацетилирования), коньюгации.

Мембраны: Na –K –АТФаза, аденилатциклаза, ферменты транспорта субстратов.

Цитоплазма: ферменты гликолиза, активации аминокислот, синтеза жирных кислот.

Мультиферментные системы локализуются в структуре органелл таким образом, что каждый фермент располагается в непосредственной близости от следующего фермента данной последовательности реакции. Благодаря также компартментализации в клетке могут одновременно протекать 2 несовместимых процесса: в -окисление жирных кислот в митохондриях и синтез жирных кислот в цитоплазме).