Способы подготовки клеток к глубокому замораживанию

АБК.

Важная роль в адаптации клеток растений к низким температурам принадлежит фитогормону АБК (абсцизовая кислота). На многих растениях из разных систематических групп показано увеличение содержания АБК при пониженных температурах, причем у разных видов степень увеличения была различна. Холодовая дегидратация сопровождается значительным повышением концентрации гормона в растительных тканях и синтезом в них новых белков. Активность многих генов и белков, которые экспрессируются при низкой температуре или водном дефиците, может быть индуцирована обработкой АБК.

Таким образом, накопление АБК в ткани при пониженной температуре приводит к экспрессии ряда генов и появлению криопротекторных белков.

Окислительный стресс.

При низких температурах наблюдается интенсивное образование АФК (активных форм кислорода), в клетке накапливаются супероксид-радикалы кислорода, гидроксил-радикалы (-ОН), перекись (Н₂О₂) и развивается окислительный стресс.

Окислительный стресс является центральным фактором многих абиотических стрессов. Возросший уровень АФК действует как внутриклеточный сигнал, реагируя на который клетка включает защитные программы и изменяет свой метаболизм.

Важный фактор устойчивости клеток к низкотемпературному воздействию – функционирование мощной антиоксидантной системы. В эту противоокислительную систему входят высокомолекулярные антиоксиданты – ферменты, такие как супероксиддисмутаза (СОД), каталаза, пероксидаза, глутатион-редуктаза, а также низкомолекулярные – аскорбат, альфа-токоферол (витамин Е), глутатион, фенольные соединения. При низкотемпературном стрессе активность антиоксидантных ферментов значительно возрастает, увеличивается и содержание низкомолекулярных антиоксидантов. Все это способствует снижению повреждения клеток при действии низких температур.

Для расширения применения криосохранения, учитывая повреждающие факторы, необходимо разрабатывать различные методы подготовки клеток к действию низких температур.

Устойчивость клеток зависит от их исходного морфофункционального состояния, которое определяется особенностями культивирования, фазой роста и т.д. Так клетки в стационарной фазе обладают наиболее высокой устойчивостью. Можно подвергать замораживанию клетки и в логарифмической фазе роста, тогда для них необходимо подобрать оптимальную скорость охлаждения, иногда возникает необходимость в применении криопротекторов.

Технологически процесс криоконсервации многоэтапен. Первый этап - стадия предварительного культивирования перед криоконсервированием. От состава среды культивирования в ряде случаев зависит криоустойчивость организмов. Отмечено, положительное влияние на криоустойчивость как краткой инкубации клеток при пониженной температуре, так и закаливания - естественной подготовки морозоустойчивых клеток. Закаливание суспензий клеток проводят, постепенно снижая температуру культивирования и одновременно увеличивая концентрацию сахарозы в среде, затем добавляют и разные криопротекторы. Однако способность к закаливанию генетически детерминирована (клетки ели закаливаются, а лимона – нет).

Другой физиологический способ подготовки к криосохранению основан на снижении водного потенциала среды при добавлении в нее осмотически активных веществ – криопротекторов. Криопротекторами могут служить ДМСО, глицерин, сахароза, манит, сорбит, трегалоза и смеси этих растворов. Положительный эффект данной подготовки к криосохранению связан со снижением оводненности клеток.

Следующий способ подготовки связан с известной физиологической ролью некоторых аминокислот, в особенности пролина, при различных стрессах, обусловленных водным дефицитом. Для этих целей применяют также аланин, аспарагин, серин и глицин.

Как известно, образование стрессовых белков, обуславливающих устойчивость к низким температурам, регулируется фитогормоном АБК. Для целей криоконсервирования растительных объектов важна возможность увеличения морозоустойчивости и формирования защитных механизмов в результате воздействия на клетки экзогенной АБК.

При наблюдении за клетками под криомикроскопом четко видно образование внутриклеточного льда, находящееся в прямой зависимости от степени переохлаждения, от скорости замораживания, от наличия или отсутствия инициации кристаллизации раствора, окружающего клетки. Так при криосохранении клеток, тканей растений и микроорганизмов целесообразно применять программное замораживание с инициацией кристаллизации и скоростью охлаждения на первом этапе замораживания 0,25^о – 1,0^оС/мин (до -40^оС). На втором этапе увеличивать скорость до 9-10^оС /мин и около -60^оС быстро погружать в жидкий азот.

Этап удаления криопротекторов и рекультивирования также требует особых предосторожностей, т.к. выжившие клетки перенесли сильнейший стресс и частично повреждены. Для сохранения таких клеток необходимо свести к минимуму все воздействия, которые могут дополнительно повредить клетки и плазмалемму.

Таким образом, если к моменту глубокого замораживания клеточные штаммы имели способность к регенерации, то и после криосохранения также имеется возможность регенерировать растения из этих клеток независимо от сроков хранения в жидком азоте, так как эмбриогенные и морфогенетические потенции в результате криосохранения не изменяются. Конечно, если режим хранения не был нарушен, т.е. температура никогда не превышала -140^оС, а все этапы криоконсервирования были достаточно оптимизированы. Следовательно, криосохранение является фактической консервацией в состоянии анабиоза (криобиоза), когда все процессы жизнедеятельности прекращены, но при правильном оттаивании и рекультивировании их можно возобновить и «оживить» биологические объекты.

Криосохранение достаточно надежно обеспечивает сохранение генофонда. К настоящему времени в Институте физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН разработаны способы криосохранения более 20 клеточных штаммов, полученных из 13 видов растений, и меристем земляники, наперстянки, ромашки, малины, гвоздики и картофеля. Из них 14 штаммов - продуценты экономически важных веществ. Полное восстановление роста культур получено после 25 лет хранения. Возобновленные культуры сохранили все свои основные характеристики, клетки картофеля, моркови и меристемы регенерировали растения. Кроме того, в криобанке хранятся семена более 100 видов охраняемых растений, собранных сотрудниками разных институтов на пространстве от Балтики до Курил.