Стафилококов, выделяемых от животных

Таблица 3 - Биохимические признаки и другие свойства

Лецитиназа.Фермент бактерий, расщепляющий лецитин, выявляют пу­тем посева культуры стафилококков на желточный агар. Готовят желточный агар: пептон — 20 г, гидрофосфат натрия — 2,5 г, натрий — 1 г, 0,5%-й раствор сульфата магния — 0,1 мл, глюкоза — 1 г, агар — 12,5 г, вода дистиллированная — 500 мл. Устанавливают рН 7,2-7,4, стерилизуют при 121°С 15 мин, охлаждают до 55 °С, добавляют один стерильный желток на 500 мл среды, компоненты перемешивают и смесь разливают в чашки Петри. Исследуемую культуру засевают дробно на желточный агар, культивируют при 37-38 °С 24-48 ч. Положительный результат — появление зоны помутнения вокруг колоний.

Таблица 2 - Свойства основных патогенных видов стафилококков

Грамположительных кокков

Таблица 1 - Дифференциация стафилококков от других

Признаки	Стафилококки	Микрококки	Энтерококки	Стрептококки
Ферментация глюкозы (ОФ-тест)	+	-	+	+
Каталаза	+	+	-	-
Оксидаза	-	+	-	-
Коагулаза	+	-	-	-
Чувствительность к бацитрацину (0,04 ЕД/диск)	-	+	-	-

Определение патогенных свойств стафилококков, идентификация на уровне вида. Достаточно подробное изучение патогенных свойств стафилококка позво­ляет отнести выделенную культуру к одному из трех основных патогенных видов (табл.2). Исследование дополнительных ферментативных, культуральных и прочих свойств дает возможность идентифицировать другие виды ста­филококков, достаточно часто выделяемые от животных (табл. 3). О присут­ствии патогенных свойств у выделенных культур судят, кроме того, по резуль­татам биопроб, позволяющих, в том числе, доказать наличие энтеротоксина. Определение факторов патогенности проводят следующими методами.

Коагулаза. Фермент, вызывающий свертывание плазмы, на фибриноген непосредственно не действует. Для этой цели наиболее подходит цитрированная плазма кролика (1 объем 4%-ного раствора натрия цитрата + 9 объемов крови). При исследовании штаммов, выделенных от определенных видов жи­вотных, может быть использована их кровь (свиньи, КРС, собаки).

Цитратную кровь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 минут, плазму отсасывают в стерильные пробирки, закрывают пробками, хранят до 3 недель при 4-5° С. При постановке опыта плазму разводят стерильным физиологическим раствором 1:5 и разливают по 0,5 мл в стерильные пробирки. Испытуемую культуру выращивают на МПА или МПБ 18-24 часа и вносят две капли бульонной или одну петлю агаровой культу­ры в пробирки с подготовленной плазмой. Параллельно проводят контроль плазмы без культуры бактерий. Пробирки ставят в термостат (37-38° С). Учет проводят через каждый час в течение 5-6 часов, при комнатной темпе­ратуре 18 часов. Положительный результат — образование сгустка, кото­рый при наклоне пробирки удерживается. Стафилококки с выраженной патогенностью свертывают плазму в сроки до 2 часов. Наличие коагулазы наиболее четко коррелирует с патогенностью стафилококка.

Признаки	S. aureus *	S. intermedius	S. hyicus
Коагулаза (плазма кролика)	+	d	D
Гемолизин (эритроциты КРС)	+	-	-
Гиалуронидаза	+	-	+
Лецитиназа	+	Н.Д.	Варьирующий признак (чаще +)
Протеин «А»	+	Варьирующий признак	+
ДНК-аза	+	+	+
Ферментация маннита аэробно анаэробно	+ +	+ -	- -
Мальтоза	+	(±)	-
Образование пигмента	+	-	-

* — Анаэробный подвид S. aureus (S. subsp. anaerobicis) образует коагулазу, ДНК-азу, гемолизин, ферментирует мальтозу, не синтезирует пигмент (±) — 90% или более штаммов слабо позитивные d — 11-89% штаммов позитивные.

Фактор скучивания (Сhumping factог-СF). СF -фактор в отличие от коагула­зы действует на фибриноген, что приводит к агрегированию стафилококков. Для выявления СF -фактора на предметном стекле в капле неразведенной цитратной плазмы суспендируют бактериальную массу стафилококков из агаро­вой культуры при помощи бактериологической петли. В положительных слу­чаях агрегирование наступает в течение 1-2минут. Контролем служит взвесь стафилококков в физиологическом растворе. Результаты СF -теста хорошо коррелируют с результатами пробирочной пробы на коагулазу.

Фибринолизин (стрептокиназа). Исследуемую культуру микроорганизма засевают в виде «бляшки» на агар с 12 % цитрированной плазмы. Посевы инкубируют при 37 °С 23-24 ч. Положительный результат — появление зоны просветления вокруг колонии.

Протеин «А». Белковое вещество, которое часто обнаруживают на по­верхности клетки S. aureus и S. hyicus, обладает способностью неспецифически связывать Fс-фрагменты молекул JgG. Обнаружение протеина «А» у стафилококков проводят следующим образом. Отмытые центрифугированием эритроциты барана суспензируют в физиоло­гическом растворе, смешивают с гемолизином, разведенным физиологическим раствором. Компоненты выдерживают при 37°С. Эритроциты отмывают ценрифугированием и ресуспендируют в исходном объеме фгоиологического раство­ра. Каплю суспензии сенсибилизированных эритроцитов смешивают с бактери­альной массой стафилококков при помощи бактериологической петли на пред­метном стекле. За счет протеина «А» стафилококков происходит агглютинация эритроцитов, содержащих на своей поверхности JgG (гемолизин).

Гемолизины. Гемолитическую активность исследуют посевом на кро­вяной агар. Гемолизины стафилококков отличаются биохимическими, ан­тигенными свойствами и литической активностью по отношению к эритро­цитам различных видов животных. Известны четыре типа гемолизинов ста­филококков (табл. 4).

Конкретный штамм стафилококков может синтезировать один тип ге­молизина или несколько в различных комбинациях. При тестировании ге­молитической активности у штаммов, особенно от КРС, необходимо учи­тывать наличие β-гемолизина и целесообразность дополнительного выдер­живания посевов после инкубирования также при 4-15° С.

S. aureus, S. intermedius могут синтезировать одновременно α- и β -гемолизин, что при­водит к образованию двойной зоны гемолиза: вблизи колонии — типа α, далее — β.

Таблица 4 -Спектр активности гемолизинов стафилококков

Гиалуронидаза (фактор проникновения). Обнаружение этого фермен­та у стафилококков практически наиболее легко осуществимо в тесте декапсуляции. Берут штаммы капсулообразующих видов бактерий, имею­щих в составе капсулы гиалуроновую кислоту (субстрат для гиалуронидазы): Str. equi, Раsterella multocida (серовар А). На кровяной МПА в чашке Петри крестообразно засевают штрихом Str. equi или Р. multocida (тип А) и под углом 90° аналогично в виде линии культуру испы­туемого стафилококка. Посевы инкубируют при 37° С в течение 24 часов. При наличии гиалуронидазы колонии тест-микроба вблизи штриха ста­филококков образуются более мелкие и тусклые за счет разрушения кап­сулы ферментом, который диффундирует в толщу агара (результат поло­жительный).

ДНК-аза. Нуклеаза обычно выявляется у S. aureus, S. intermedius,
S. hyicus. Исследуемую культуру бактерий засевают на питательный агар с ДНК и культивируют при 37 °С 24 ч. Затем на поверхность среды с бактериальной культурой наливают 1 н. раствор соляной кислоты. Положительный результат — при гидролизе ДНК вокруг выросшей культуры видна светлая зона.

Биопроба. Проводят для выявления патогенных свойств штаммов по летальному эф­фекту (биопроба на цыплятах), положительной дермонекротической реак­ции (некротоксин), а также на котятах для обнаружения способности про­дуцировать энтеротоксин. Известно шесть антигенноразличных энтеротоксинов (А, В, С, D, Е, F).

Дермонекротическая проба. У кролика-альбиноса массой 2-2,5 кг за сутки до опыта на боку выстригают два участка размером 2x2 см. 24-часо­вую бульонную испытуемую культуру вводят внутрикожно в дозе 0,2 мл на обоих участках. Положительный результат: через 24 часа на месте инъек­ции появляется гиперемия кожи, через 48 часов - некроз. Наблюдение про­должают 4 суток.

Биопроба на цыплятах. Проводят при изучении штаммов, выделенных от птиц. Суточную бульонную культуру в объеме 0,1 мл вводят во внешний угол глазницы двум 1-2-дневным цыплятам. Наблюдение ведут в течение 5 суток. Положительный результат: гибель цыплят на 3-5 сутки при выде­лении культуры стафилококков из паренхиматозных органов и костного мозга цыплят.

Обнаружение энтеротоксина в биопробе на котятах. Испытуемую куль­туру стафилококка засевают на среду для получения стафилококкового эн­теротоксина. Культуру стафилококка выращивают на специальной питательной среде (пептон, хлорид кальция, хлорид магния, дигидрофосфат калия, 0,8 % агар-агара, рН 7,2), в атмосфере, содержащей 20 % оксида углерода в течение трех суток. Посе­вы инкубируют в эксикаторе с 20% СО₂, что достигается смешением на дне сосуда (емк. 2000 мл) 2 г двууглекислой соды с 17 мл 10%-ный серной кисло­ты, после чего крышку эксикатора сразу закрывают. Посевы инкубируют при 37° С 3 суток, ежедневно дополняя вышеописанным способом СО₂ в эк­сикаторе. На 4 сутки содержимое колбы фильтруют через мембранные филь­тры № 3 или № 4. Приблизительно 10-15 мл фильтрата смешивают в рав­ной пропорции с теплым молоком и скармливают 4-8-недельным котятам. Положительный результат: через несколько минут котята проявляют беспо­койство, через 1-3 часа появляются симптомы гастроэнтерита: понос, рво­та. Возможен летальный исход.

В специализированных лабораториях, при наличии соответствующих реактивов, энтеротоксин выявляют серологическими методами. Испытуе­мый штамм выращивают на подходящей среде, например сердечно-мозго­вом бульоне, и супернатант исследуют.

Серологически энтеротоксин обнаруживают в РДП или при помощи иммуноферментного метода. Возможно об­наружение токсинообразования следующим способом. К расплавленному и остуженному до 45°С МПА добавляют антитоксическую стафилококко­вую сыворотку
(S. аureus) до содержания в 1 мл среды 14-15 АЕ. Агар разливают по чашкам Петри и засевают дробно изучаемую культуру для получения изолированных колоний. Посевы инкубируют при 37° С 24-48 часов. Вокруг колоний токсигенных стафилококков формируются кольца преципитации.

Фаготипирование стафилококков. Проводят для обнаружения источ­ника возбудителя и установления эпизоотологических (эпидемических) связей. Фаготиповая принадлежность является маркером, позволяющим устанавливать идентичность штаммов, даже если другие характеристи­ки подверглись изменениям. Для фаготипирования S. аureus существует международный набор фагов, включающий 21 фаготип, разделенный на 5 фагогрупп (I-V). Для типирования штаммов, выделенных от КРС, предложен свой набор фагов, состоящий из фаготипов 42 Д, 78, 102, 107, 117, 118, 119. Техника фаготипирования сводится к следующему. Исследуемую культуру выращивают на скошенном МПА при 37-38° С в течение 18-24 часов, пересевают в пробирку с 2,5 мл бульона Хоттингера, инкубируют при 37° С 3-4 часа, засевают газоном в чашки Петри на 1,25%-ной МПА (рН 7,2-7,4) с 0,4% глюкозы и 0,02% каль­ция хлорида. Засеянные чашки подсушивают 30-40 минут в термоста­те, расчерчивают дно чашки на необходимое количество квадратов и стандартной бактериологической петлей (d=2 мм) в каждый квадратик вносят тот или иной фаг в рабочем титре. Бактериологическую петлю после каждой манипуляции прожигают. Посевы инкубируют 5-6 часов при 37° С или 18-20 часов при 30° С. Штаммы, не лизированные набо­ром фагов, проверяют повторно, используя более концентрированный фаг (х 100). Степень лизиса оценивают по следующей схеме: «+ + + +» — полный лизис; «+ + +» — наличие в зоне лизиса колоний стафилококка; «+ +» — в зоне капли фага обнаруживают более 50 колоний фага; «+» — от 20 до 50 колоний фага;
«-» — полное отсутствие лизиса.

Штаммы стафилококков чаще лизируются несколькими фагами. В зависимо­сти от спектра фагочувствительности стафилококк относят к какой-либо одной фагогруппе, например I, II и т. д., или к смешанной группе (I и III и т.д.).