Реакция агглютинации.Ускоренная индикация морганелл в реакции нейтрализации антител (РНАт). Морганеллы имеют соматический
О- и жгутиковый Н-антигены. У отдельных штаммов обнаружено наличие поверхностного К-антигена.
О-антиген является полисахаридо-липидо-протеиновым комплексом, термостабилен (выдерживает прогревание при 100° С в течение 2,5 часов и автоклавирование при 121° С, т.е. 1 атм. в течение 1 часа). По О-антигену в Классификационной антигенной схеме Рауса-Вороса к 1980 году насчитывалось 47 серологических групп морганелл. Однако этот перечень не охватывает всего многообразия серогрупп данных бактерий, и к настоящему времени он существенно расширен.
Н-антиген является белком, термолабилен. Прогревание при 100° С приводит к быстрому разрушению жгутикового антигена и утрате им агглютинабельных свойств. Кипячение культуры в течение 2,5 часов вызывает потерю ее Н-агглютиногенных свойств.
К-антиген является поверхностным, термолабильным полисахаридным комплексом, сходным по составу с В-антигеном эшерихий, но при этом не препятствует агглютинации клеток специфическими
О-сыворотками.
Совокупность названных антигенов определяет серовариант М. niorganii. Серогрупповую принадлежность морганелл устанавливают в реакции агглютинации со специфическими О-сыворотками. При этом до пускается использование как живой, так и инактивированной культуры. Серовариант, при необходимости, устанавливают с помощью дополнительной постановки РА с К- и Н-агглютинирующими сыворотками. При этом в качестве антигена используют только живые культуры.
Патогенность изучаемых культур морганелл устанавливают по их принадлежности к серологическим группам, наиболее часто вызывающим диарею у молодняка сельскохозяйственных животных. С этой целью используют набор сывороток нативных морганеллезных агглютинирующих се-рогрупповых к 8 серологическим группам: 0l; 016; 026; 029; 033; 045; 049 и «13».
Исследования начинают с постановки пластинчатой РА с каждой из серогрупповых сывороток, входящих в набор. Антиген для РА готовят из 18-24-часовой агаровой культуры, которую смывают стерильным физиологическим раствором (3-4 см3 на 1 пробирку культуры на скошенном МП А). Суспензию прогревают при 100° С в водяной бане в течение 10 -15 мин, центрифугируют 20 мин при 3-5 тыс. об/мин, после чего большую часть надосадочной жидкости удаляют и утилизируют, а меньшую часть (1-1,5 см3) смешивают с осадком и используют в качестве антигена в пластинчатой РА.
Для постановки пластинчатой РА сыворотки разводят 1:10 в стерильном физиологическом растворе и каждую из них по капле наносят на чистое обезжиренное предметное стекло. Во все капли сывороток вносят и хорошо размешивают бактериологической петлей антиген. Результаты реакции учитывают при комнатной температуре в течение 3 мин. Положительная реакция характеризуется образованием зерен агглютината и полным просветлением жидкости. При отрицательной — агглютинат не образуется, жидкость остается мутной. Возможна сомнительная реакция, при которой образуется незначительное количество зерен (хлопьев) агглютината, но жидкость остается слабо-мутной.
При наличии положительной реакции на стекле с одной и более серогрупповыми сыворотками ставят развернутую пробирочную РА с этими сыворотками. Оставшийся после пластинчатой РА антиген (или приготовленный заново по вышеуказанной методике) разводят физиологическим раствором до концентрации 1 млрд. микробных клеток в 1 см3 по оптическому стандарту мутности и используют для постановки развернутой РА в пробирках.
Из серогрупповых сывороток готовят исходные разведения 1:50 в карболинизированном физиологическом растворе (0,5% фенола). Для этого 0,1 см3 нативной сыворотки смешивают с 4,9 см3 карболинизированного физиологического раствора либо 0,5 см3 сыворотки, разведенной 1:10, смешивают с 2 см3 карболинизированного физиологического раствора. Из исходного разведения готовят двукратные разведения сыворотки от 1:100 до 0 — титров, указанных на этикетках флаконов с гомологичными сыворот ками. В подготовленный ряд пробирок с 0,5 см3 разведенных сывороток пиосятпо 0,5 см3 антигена.
Одновременно ставятся контроли па спонтанную агглютинацию антигена (0,5 см3 антигена + 0,5 см3карболинизированного физиологического раствора) и флокуляцию сывороток (1 см3 сыворотки в разведении 1:100).
Опытные и контрольные пробирки встряхивают, помещают в термостат При 37-38° С на 16-18 часов, а затем выдерживают их дополнительно при комнатной температуре 5 -6 часов. После указанного срока учитывают результаты реакции общепринятым методом в крестах.
При положительной РА в разведении сыворотки не ниже 1:400 с оценкой не менее чем ++ (два креста) и отрицательных контролях культуру относят к соответствующей серогруппе морганелл. Если агглютинация наблюдается с несколькими сыворотками к разным серогруппам, то культуру относят к той серологической группе, с сывороткой к которой была получена положительная реакция в наибольшем разведении. Если культура агглютинирует с разными сыворотками в одинаковом титре, то учитывают активность этих сывороток, и серогрупповую принадлежность определяют по сыворотке, имеющей минимальную активность (минимальные О — титры, указанные на этикетках флаконов).
Если РА оказалась отрицательной со всеми сыворотками набора, то Патогенность выделенных культур устанавливают путем постановки биопробы. Реакция нейтрализации антител предназначена для ускоренной индикации эпизоотических штаммов морганелл в патологическом материале, кормах, объектах внешней среды. Она позволяет обнаружить искомые бактерии в первичных культурах в течение 6-7 часов независимо от присутствия в них посторонних бактерий. Это Исключает необходимость получения чистых культур морганелл с последующей их видовой идентификацией и определением патогенных свойств в биопробе на белых мышах.
Для постановки РНАт необходимо три компонента: исследуемый с целью обнаружения морганелл материал; морганеллезные агглютинирующие серогрупповые сыворотки; эритроцитарные морганеллезные диагностикумы (3-4%-ная взвесь формалинизированных эритроцитов барана, на которых адсорбирован О-антиген морганелл определенной серологической группы из числа 8, наиболее часто вызывающих диарею у молодняка животных).
В первой фазе реакции участвуют исследуемый материал и агглютинирующие О-сыворотки. Во вторую фазу к этим компонентам добавляется эритроцитарный диагностикум. Если в исследуемом материале есть морганеллы серогрупп 0l, 016, 026, 029, 033, 045, 049, «13» (О-антигены этих бактерий), то они связываются с антителами агглютинирующей сыворотки (визуально невидимый эффект). При последующемдобавлении эритроцитарного диагностикума последние не могут участвовать в склеивании (агглютинации) эритроцитов, которые образуют на дне лунок полистироловой пластины осадок в форме диска или кольца (положительный результат РНАт). При отсутствии в исследуемом материале морганелл названных серогрупп антитела сывороток остаются свободными в первой фазе реакции и агглютинируют эритроциты во второй ее фазе, что ведет к образованию на дне лунок осадка в виде «зонтика» (отрицательный результат РНАт).
Точность результатов РНАт зависит от правильно подобранного соотношения эритроцитарных диагностикумов и морганеллезных агглютинирующих сывороток, которое определяют в реакции непрямой гемагглютинации(РНГА).
Для постановки РНГА готовят забуференный физиологический раствор с рН 7,0 -7,2. С этой целью в первую мерную колбу вносят 23,0 г Na2HP04, во вторую — 9,0 г КН2Р04. В обе колбы добавляют дистиллированную воду до отметки 1 литр и тщательно растворяют их содержимое.
К 1 литру свежеприготовленного физиологического раствора с рН 6,2-6,6 добавляют 10 см3 смеси 1/15 М растворов Na2HP04H КН2Р04в соотношении 7:3 или 8:2 (в зависимости от исходной величины рН физиологического раствора), содержимое колбы тщательно перемешивают. Забуференный физиологический раствор разливают по 0,4 см3 во все лунки полистироловой платины (кроме первой лунки каждого ряда).
Агглютинирующую сыворотку к определенной серогруппе морганелл разводят забуференным физраствором в отношении 1:100 и вносят по
0,4 см3 в первую (пустую) и вторую лунки двух первых рядов полистироловой пластины, а также в две пустые лунки отдельной пластины (контроль сыворотки и эритроцитарного диагностикума).
Сыворотку во вторых лунках двух первых рядов перемешивают с забуференным физраствором, получая разведение сыворотки 1:400 и т.д. до 12-й лунки, в которой получают разведение сыворотки 1:204800. Из последней 12-й лунки ряда 0,4 см3 жидкости удаляют.
Аналогичным образом, т.е. по два ряда для получения разведений от 1:100 до 1:204800, разливают другие серогрупповые морганеллезные сыворотки. Двукратное исследование каждого компонента реакции необходимо для получения более достоверных результатов реакции.
В приготовленные разведения сывороток вносят по 0,05 см3 (одна капля) морганеллезного эритроцитарного диагностикума, гомологичного серогруппе агглютинирующей сыворотки.
Одновременно на отдельной полистироловой пластине ставят следующие контроли: 1) контроль сывороток для исключения неспецифической гемагглютинации (0,4 см3 сыворотки в разведении 1:100+0,05 см3 3,5-
4%-ной взвеси нормальных формалинизированных эритроцитов барана);
2) контроль эритроцитарных диагностикумов для исключения спонтанной агглютинации сенсибилизированных эритроцитов (0,4 см3 забуференного физраствора + 0,05 см3эритроцитарного диагностикума).
Пластины осторожно встряхивают для смешивания компонентов и оставляют на 3 часа при комнатной температуре. После указанного срока учитывают результаты РНГА.
Во всех лунках полистироловой пластины с контролями реакция должна быть отрицательной (отсутствие гемагглютинации, осадок эритроцитов в виде диска или кольца). При положительной РНГА эритроциты склеиваются, образуя на дне лунок осадок в виде «зонтика».
Активность эритроцитарных морганеллезных диагностикумов устанавливают по наибольшему разведению гомологичной морганеллезной агглютинирующей О-сыворотки, в котором получена положительная РНГА. Данное разведение сыворотки принимают за одну гемагглютинирующую единицу (1 ГЕ).
Морганеллезный эритроцитарный диагностикум, имеющий в РНГА с гомологичными агглютинирующими сыворотками разных серий титр ниже 1:6400, для постановки РНАт не пригоден.
Подготовка материала для исследования и постановка РНАт. Исследуемый материал высевают на плотные селективные питательные среды (агар Плоскирева, висмут-сульфит агар и др.). Посевы инкубируют при 37 -38° С в течение 18 -24 часов, после чего их просматривают, обращая внимание на наличие характерных для морганелл колоний. При необходимости получения чистой культуры для дальнейшей ее родовой и видовой идентификации на скошенный МПА отсевают с агара Плоскирева серовато-голубоватого цвета, а с висмут-сульфит агара зеленовато-оливкового цвета мелкие полупрозрачные колонии S-формы. Оставшийся материал смывают с чашки Петри 6-8 см3 стерильного забуференного физраствора. Полученную бактериальную суспензию прогревают в водяной бане при 100° С в течение 15-20 минут и используют для постановки РНАт.
Во все лунки полистироловых пластин наливают по 0,2 см3 забуференного физраствора. В первую лунку каждого ряда вносят 0,2 см3 суспензии, исследуемой на наличие морганелл, и готовят ее последовательные двукратные разведения от 1:2 до 1:64 в первых шести лунках каждого ряда. Число рядов лунок с разведениями одного и того же материала должно соответствовать количеству серогрупповых агглютинирующих сывороток и эритроцитарных диагностикумов, используемых в РНАт.
Во все лунки ряда с разведенным исследуемым материалом вносят по 0,2-0,3 см3 морганеллезной агглютинирующей сыворотки определенной серогруппы в разведении 4 ГЕ (например, если в РНГА 1 ГЕ соответствовала разведению сыворотки 1:25600, то 4 ГЕ будет соответствовать разведение этой сыворотки 1:6400). Одновременно для контроля сыворотки то же ее разведение в количестве 0,2 см3 вносят в две лунки с 0,2 см3 забуфе ренного физиологического раствора на отдельной пластине. В результате получают разведение сыворотки, соответствующее 2 ГЕ.
Пластины осторожно встряхивают для перемешивания компонентов реакции и помещают в термостат при 37-38° С на 1 час. Затем их извлекают из термостата и во все лунки одного ряда добавляют по 0,05 см3 морганеллезного эритроцитарного диагностикума, соответствующего серогруппе агглютинирующей сыворотки в данном ряду. Одновременно на отдельных пластинах ставят два контроля: 1) контроль гемагглюти-нирующей способности сыворотки (серогрупповая морганеллезная агглютинирующая сыворотка, использующаяся в основном опыте в разведении 2ГЕ и в объеме 0,4 см3 + 0,05 см3 гомологичного эритроцитарного диагностикума); 2) контроль исследуемого материала для исключения неспецифической агглютинации эритроцитов (в лунки с разведениями суспензии бактерий от 1:2 до 1:64 в объеме по 0,4 см3 добавляют по 0,05 см3 3,5-4%-ной взвеси нормальных формалинизированных эритроцитов барана). Пластины вновь встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 3 часа. После указанного срока учитывают результаты РНАт.
В контроле сывороток должна наблюдаться агглютинация эритроцитов с образованием в лунках «зонтиков». В контроле исследуемой суспензии бактерий во всех разведениях — отсутствие агглютинации (осадок эритроцитов в виде диска или кольца). При данных результатах кон-тролей реакцию считают положительной в том ряду полистироловой пластины, где эритроциты выпадают в осадок в виде диска или кольца (нет их агглютинации) в разведении исследуемого материала от 1:8 и выше. Положительная реакция только в первых двух лунках ряда, а также в контроле исследуемого материала в разведениях 1:2-1:4 не принимается во внимание ввиду возможности неспецифической агглютинации эритроцитов.
При отрицательной реакции осадок на дне лунок имеет форму «зонтика», что указывает на отсутствие в исследуемом материале морганелл серогрупп, соответствующих использованным эритроцитарным диагностикумам.
Критерием циркулирования на ферме эпизоотических штаммов морганелл по результатам РНАт является повторяемость результатов исследования — обнаружение в большинстве проб материала бактерий одних и тех же серогрупп.
Биопроба. Испытуемый штамм морганелл выращивают на МПА при 37-38° С в течение 18-24 часов, смывают стерильным физиологическим раствором и готовят суспензию концентрацией 1 млрд. микробных клеток в 1 см3 по оптическому стандарту мутности. Приготовленную суспензию вводят внутрибрюшинно по 0,5 см3 трем белым мышам массой 14-16 г. Наблюдение за зараженными животными проводят в течение трех суток. В случае гибели двух и более зараженных мышей испытуемый штамм морганелл признают патогенным.