Микроскопическое исследование исходного материала, обнаружение антигенов и ДНК возбудителя
Бактериологическое исследование
Лабораторная диагностика мелиоидоза
Мелиоидоз (ложный сап) — редко встречающееся инфекционное заболевание некоторых видов животных и человека в районах Юго-Восточной Азии, северных провинциях Австралии, в виде спорадических случаев в странах Европы, Африки, Северной Америке, Китае, В РФ мелиоидоз не регистрируется. Мелиоидоз характеризуется лихорадкой, катаральногнойным воспалением слизистых оболочек, образованием казеозных узелков и гнойных очагов в различных органах и тканях. В естественных условиях восприимчивы к мелиодозу грызуны, собаки, кошки, свиньи, овцы, крупный рогатый скот, лошади, ослы, а также человек. Возбудителем болезни является грамотрицательная палочковидная бактерия Burkholderia pseudomallei, род Burkholderia, ранее Pseudomonas pseudomallei. Лабораторная диагностика болезни основана на результатах бактериологического и серологического исследований.
|
|
Материалом для бактериологического исследования при жизни служат: гнойное отделяемое язв, содержимое абсцессов, кровь, моча, мокрота, выделения из носовых отверстий, глаз. Посмертно берут участки пораженных тканей, кровь, кусочки внутренних органов, лимфатические узлы. Взятие и пересылку материала проводят согласно режиму работы с особо опасными инфекциями.
Из материала готовят мазки для окраски по Граму, люминесцентно-серологического и иммуноферментного исследования. В положительных случаях в мазках, окрашенных по Граму, обнаруживают полиморфные, грамотрицательные, нередко биполярные палочковидные бактерии с закругленными концами размером 3-6х0,3-0,6 мкм. Клетки возбудителя окружены массивной слизистой капсулой. По данным ученых, присутствие капсулы отражает определенный антигенный состав и вирулентность возбудителя. Апробирована ПЦР с целью выявления ДНК возбудителя в исследуемом материале.
Культивирование. В. pseudomallei — факультативный анаэроб, температурный оптимум 37° С, диапазон 14-44° С, рН питательных сред 6,8-7,0, диапазон 5,6-8,5. Возбудитель не требователен к питательным средам, но лучше растет на субстратах с добавлением 4-5% глицерина. Обычно посев производят на мясопептонный агар и бульон с глицерином. Кон-таминированный материал рекомендуется в течение 3 часов обработать пенициллином (1000 ЕД/мл) и высевать на М ПА с кристаллвиоле-том (1:200 000), на синтетическую среду с Р-аланином и неомицином. Посевы инкубируют при 37° С, в аэробных условиях в течение 5-6 суток, ежедневно просматривая. В.pseudomallei, в отличие от В.mallei, не способен расти при 42° С.
|
|
Отличительной особенностью В.pseudomallei от В.mallei является способность к росту на средах без глицерина. В положительных случаях на МПА с глицерином через сутки инкубирования формируются мелкие, полупрозрачные, сероватого цвета колонии с ровными краями, выпуклые, с гладкой поверхностью, которые напоминают колонии эшерихий, но более мелкие. На кровяном агаре некоторые штаммы вызывают а -гемолиз. Нередко вырастают крупные слизистые колонии, диаметром до 6 мм, правильной круглой формы, выпуклые, слегка опалесцирующие. Наиболее часто колонии этой морфологии образуются при исследовании мокроты.
На вторые сутки и позднее колонии теряют прозрачность, проявляются признаки диссоциации: часть колоний остаются блестящими, гладкими, с ровными краями, у других формируется шероховатая или складчатая поверхность, неровный, зубчатый край, они отдаленно напоминают старые колонии микобактерий туберкулеза. Таким образом, в посевах могут присутствовать S-, R-, М- и промежуточные формы колоний.
В МПБ рост возбудителя через 10-12 часов характеризуется легким помутнением среды, через 24-30 часов помутнение становится сильным, образуется осадок и поверхностная пленка, которая спустя 4-5 суток делается складчатой, превращается из серо-желтоватой в коричневатую, после добавления нейтрального красного пленка окрашивается в оранжево-красный цвет. Культуры В.pseudomallei имеют специфический запах плесени.
Морфологические и тинкториальные свойства B.pseudomallei в культуре. В мазках из культуры клетки возбудителя имеют морфологию, сходную с наблюдаемой в патологическом материале; клетки мелкие, располагаются единично, парами, короткими цепочками, «обоймами» по 5-7 штук. При старении культур образуются скопления по 8-10 штук, объединенные слизистой массой; клетки с возрастом удлиняются, появляется зернистость, одновременно обнаруживаются коккобактерии. Для клеток, окрашенных по Граму и другими анилиновыми красителями, характерна биполярность, спор не образуют, подвижны, движение клеток прямолинейное или змеевидное. На сывороточных средах возбудитель образует капсулу.
Идентификация B.pseudomallei по ферментативным свойствам. Для В. pseudomallei характерно наличие аргиниидигидролазы, оксидазы, желатиназы, гидролиз крахмала, денитрифицирующая активность, использование глюкозы, трегалозы, мезо-инозитола, d-валина, β-аланина,
d-аргинина, Д-рибозы, левулината, эритритола, а-амиланина, инертность по отношению к гераниолу, Д-ксилозе, d-рамнозе, сахарату, цитроконату, мезаконату, Д- и мезо-тартрат. Критерии дифференциации В.pseudomallei представлены в таблице 79. Согласно этим данным, для возбудителя мелиоидоза свойственна, в отличие от В. mallei, способность образовывать газ из нитрата (100% штаммов), кислоту на скошенном агаре TSI (72% штаммов), расти на среде Симмонса (77% штаммов), разжижать желатину (79% штаммов), изменять лакмусовое молоко (96% штаммов).
Отмечается непостоянство утилизации В. pseudomallei органических соединений. Причина такого явления окончательно не выяснена, как постоянный признак может рассматриваться окисление галактозы, маннозы, эскулина, амидона, декстрина; непостоянный — окисление арабинозы, ксилозы, глюкозы, левулезы, лактозы, мальтозы, трегалозы, раффинозы, глицерина, маннита, инулина; постоянно отрицательный — отсутствие окисления рамнозы, сахарозы, салицина, дульцита, инозита, сорбита, адонита. Система комбинированного тестирования ферментативной активности API 20 Е позволяет идентифицировать только 50-63% штаммов возбудителя. Более эффективны системы Minitek и ЕРА — 18 NF. Несовершенство методов идентификации возбудителя по фенотипическим признакам подтверждает перспективность молекулярно-генетической диагностики мелиоидоза.
|
|
Серологическая идентификация возбудителя. На различных этапах бактериологического исследования может быть использован метод флуоресцирующих антител, РНГА, ИФА. При просмотре первичных посевов на плотных питательных средах отбирают «подозрительные» колонии и проверяют их в РА на стекле. Коммерческая иммунная мелиоидозная сыворотка агглютинирует в разведении до 1:160 культуры всех известных штаммов В. pseudomallei. В РА, при использовании поликлональной сыворотки, нельзя дифференцировать В. mallei и В. pseudomalei. Возбудитель тиелиоидоза имеет антигены, родственные довольно широкому кругу гетерологичных видов бактерий, но наиболее близок по спектру антигенов с В. mallei. По результатам РА отбирают культуры для дальнейшего изучения ферментативных свойств с целью окончательной идентификации.
Биопроба. Проводят с целью выделения культуры возбудителя из исследуемого материала и установления патогенных свойств изолированной культуры. Биопробу проводят на морских свинках, золотистых хомяках и крысах (крысы резистентны к В.mallei). Если материал не загрязнен посторонней микрофлорой, то его вводят животным внутрибрюшинно, в противном случае — подкожно или наносят на скарифицированную кожу. Морским свинкам и крысам вводят соответственно по 1,0 и 0,5 мл суспензии исследуемого материала. При наличии возбудителя на месте введения материала у животных развивается отек, некроз ткани, иногда образуется язва, увеличиваются лимфатические узлы, в них образуются абсцессы; в паренхиматозных органах (легкие, печень, селезенка) формируются множественные абсцессы, заболевание сопровождается лихорадкой. Морские свинки погибают через 8-10 дней после заражения, золотистые хомяки — через 3-5 дней. У зараженных самцов может развиваться феномен Штрауса (см. «Сап»). Павших и погибших животных исследуют бактериологически с использованием всех вышеперечисленных методов.