Культивирование. Исследуемый материал после соответствующей обработки высевают согласно методическим указаниям по лабораторной диагностике инфекционной плевропневмонии коз, инфекционной агалактии овец и коз на среды Эдварда, Мартена, триптический перевар сердца крупного рогатого скота. Хороший рост М. agalactiae, M. arginini, M.putrifaciens, M. conjunctivae, микоплазм таксонов 2D, G, U, V, A. oculi, A. laidlavii наблюдается при посеве на среду Хейфлик.
Для изоляции микоплазм таксона F-38 посев материала производят на среду Yones и Wood (WYB-cpem), так как этот вид микоплазм отличается повышенной требовательностью к составу среды. При выделении микоплазм таксона F-38 рекомендуется материал измельчать, но не растирать или гомогенизировать и разводить в бульоне до 104.
С целью выделения М. ovipneumoniae посев производят на модифицированную среду Фрисс с использованием методики разведения, уреаплазм — на среду Ливингстона, Ховарда, Робертсона. М. conjunctivae выделяют посевом на плотную среду Хейфлик.
Посевы инкубируют при 37-38° С в течение 5-7 суток, ежедневно просматривая. При отсутствии роста микоплазм в течение этого срока проводят пять последовательных пассажей на средах без ингибиторов с интервалом 5-8 суток. Рост микоплазм на жидких питательных средах проявляется опалесценцией, легким помутнением. В случае роста на средах Фрисс, «WJB» микоплазм, расщепляющих глюкозу (М. ovipneumoniae, F-38), наблюдается изменение цвета среды. При росте уреаплазм на среде Ливингстона происходит ее окрашивание в красный цвет (жидкая среда) или формирование окрашенных в соответствующий цвет колоний на плотной среде.
Выделение чистых культур микоплазм и их дифференциацию от
L-форм бактерий проводят по стереотипной схеме. Морфология колоний микоплазм нa плотных средах соответствует типичной, т.е. имеет форму «яичницы-глазуньи». Исключением является М. ovipneumoniae, колонии которой на средах с 1,5-2% агара не образуют врастающего темного центра, что затрудняет, из-за смывания колоний, применение методики эпифлуоресценции для идентификации.
Отличительным культуральным признаком М. putrifaciens является нехарактерный для микоплазм гнилостный запах при росте на плотных и жидких питательных средах, образование пленки и пятен на яичной среде. Штаммы М. mycoides subsp. mycoides типа LC (козьи штаммы) отличаются от типового штамма М. mycoides subsp. mycoides (тип SC, «коровьи штаммы») размером колоний. Колонии микоплазм типа LC достигают 1 и более миллимнтров в диаметре (LC — large colony — большие колонии), при 0,5 и менее миллиметров у микоплазм типа SC (SC — sice colony — мелкие колонии). Кроме того, «козьи штаммы» более интенсивно растут в жидких питательных средах, расщепляют казеин, более устойчивы к температуре 45° С, способны к росту на агаре с 5% крови барана или крупного рогатого скота.
Идентификация выделенных культур микоплазм. С целью видовой идентификации изолированных микоплазм, помимо вышеописанных культуральных признаков, исследуют ферментативные свойства, чувствительность к дигитонину, образование пленок и пятен, наличие уреазы, казеиназы, фосфатазы, способность расщеплять аргинин и дифференцируют по критериям, изложенным в таблице 95.
Таблица 95 - Критерии дифференциации микоплазм, выделяемых
от мелкого рогатого скота (Rosendal S., 1994)
Вид (таксон) микоплазм | Чувствительность к дигитонину | Уреаза | Глюкоза | Аргинин | Фосфатаза | Пленки и пятна | Расщепление казеина |
М. agalactiae | + | _ | _ | _ | + | + | _ |
М. mycoides subsp. mycoides, тип LC | + | - | + | - | - | - | + |
М. mycoides subsp. mycoides, тип SC | + | - | + | - | - | - | - |
M. mycoides subsp. capri | + | _ | + | - | - | _ | + |
M. capricolum | + | - | + | (+)а) | + | _ | + |
Таксон F-38 | + | _ | + | _ | _ | - | + |
M. ovipneumoniae | + | - | + | - | - | - | - |
M. arginini | + | - | - | + | - | - | - |
M. putrifaciens | + | - | + | - | + | + | - |
M. conjunctivae | + | _ | + | _ | _ | + | _ |
Таксон 2D | + | - | - | - | + | + | - |
Таксон G | + | - | + | + | - | - | - |
Таксон U | + | - | - | + | + | - | - |
Таксон V | + | - | + | _ | - | _ | - |
Уреаплазмы | + | + | _ | _ | н. д. | - | н. д. |
A. oculi | _ | _ | + | _ | - | _ | - |
A. laidlawii | - | - | + | - | - | - | - |
Для серологической идентификации М. agalactiae, M. mycoides subsp. mycoides типа LC, M. mycoides subsp. capri и других микоплазм, изолированных от овец и коз, при наличии соответствующих антисывороток используют тест ингибиции роста, метод флуоресцирующих антител, РДП и другие серологические реакции. М. mycoides subsp. capri имеет много общих признаков с микоплазмами типа LC, но отличается аитигенно. Микоплазмы таксона F-38 проявляют антигенное родство с М. capricolum в РДП, реакции иммунофлуоресценции.
Биопроба. При лабораторной диагностике инфекционной агалактии овец и коз согласно действующей в РФ инструкции биопробу проводят на кроликах (масса 2,5- кг) или, в случае необходимости, на естественно восприимчивых животных (овцы или козы 1--месячного возраста). Животных заражают исследуемым материалом или выделенной культурой микоплазм. Исследуемый материал -гомогенизируют 1:10 в стерильном физиологическом растворе с ингибиторами (пенициллин — 1000 ЕД/мл, ацетат таллия —1:2000000), выдерживают 1 час при комнатной температуре. При заражении культурой применяют 3--суточную бульонную культуру. Кроликам прокалывают переднюю камеру глаза шприцом с тонкой иглой, отсасывают 0,05-0,1мл жидкости и, не вынимая иглы, вводят 0,1-0,2 мл материала. Контролем служит другой глаз, в который вводят 0,1-,2 мл стерильного бульона. Положительный результат — развитие через 5-2 дней после заражения кератита. Срок наблюдения — 30 дней. Овец и коз заражают введением материала в дозе 5 мл подкожно или в молочный канал или в дозе 2 мл в сустав. Наблюдение за животными проводят в течение 30 суток. Положительный результат — появление клиники, характерной для инфекционной агалактии. Больных животных убивают и подвергают бактериологическому исследованию.
Инструкцией по лабораторной диагностике инфекционной плевропневмонии коз в РФ предусматривается проведение биопробы на 6-2-месячных козлятах. Заражения проводят исследуемым материалом или 3-су-точной бульонной культурой 3-го пассажа. Материал предварительно подвергают обработке ингибиторами (см. выше). Двум козлятам материал в дозе 10 мл вводят внутриплеврально. Наблюдение за животным осуществляют в течение 30 дней. В положительных случаях летальный исход обычно наступает через 7-10 суток. На вскрытии обнаруживают характерные патологоанатомические изменения. Трупы животных подвергают бактериологическому исследованию.