Гемотрансфузиология

2.1. Групповые системы крови

К настоящему времени у человека известно более 300 различных групповых антигенов, объединенных в несколько групповых антигенных систем. Групповые антигены передаются по наследству и не меняются в течение жизни. Различают антигенные системы эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов и белков плазмы. Каждая групповая система состоит из двух и более антигенов, контролируемых аллельными генами. Наиболее сложной считается система резус, где установлено три пары антигенов.

Групповые антитела делятся на нормальные(врожденные) и изоиммунные, полные (относятся к классу иммуноглобулинов М) и неполные (к классу иммуноглобулинов G). Врожденные имеются в системе АВО и обозначаются греческими буквами α и β. Называются эти нормальные антитела агглютининами. Это антитела системы АВО, и редко встречающиеся антитела систем МНSs, P, Левис и др. Так как иммунные антитела наиболее активны при температуре тела человека, на этом и основываются методики их выявления. Самой чувствительной является система Кумбса.

Система АВО – основная серологическая система, определяющая совместимость или несовместимость переливаемой крови. В эту систему входят два генетически детерминированных агглютиногена – А и В и два агглютинина α (альфа) и β (бета). Сочетание агглютиногенов и агглютининов составляют четыре группы крови системы АВО у людей (табл.4).

Таблица 4.

Группа	Характеристика группы
О (I) αβ (33,5%)	На эритроцитах нет агглютиногенов, в сыворотке крови содержатся оба агглютинина αβ
А (II) β (37%)	На эритроцитах содержатся агглютиноген А, в сыворотке агглютинин - β
В (III) α (20,6%)	На эритроцитах - агглютиноген В, в сыворотке – агглютинин - α
АВ (IV) 0 (8,1%)	На эритроцитах содержатся оба агглютининогена А и В, в сыворотке нет агглютининов.

Одноименно присутствовать в крови одноименные антигены и антитела не могут. Агглютинин альфа является антителом к агглютиногену А, а агглютинин бета – по отношению к аглютиногену В.

Примерно у 12% людей агглютиноген выражен слабо, поэтому его подразделяют на подгруппы А1-А7. Антиген В подвержен такому делению в меньшей степени.

Поскольку агглютиногены А и В – изоантигены, они могут вызывать также образование изоиммунных антител неполной и полной формы анти-А и анти-В. Эти антитела также могут стать причиной гемоконфликта у пациента.

Система Левис включает два антигена Lе а и Lе в, которые образуют 3 генотипа, 4 группы. Практическое значение этой системы невелико.

Система МНSs одна из самых сложныхгрупповых систем. Ситема способна вызывать иммунизацию при переливании крови и беременности. Сочетания внутри группы составляют 108 вариантов.

Системы Келл, Даффи, Кидд, Лутеран, Ай, Диего, Оберже, Домброк и другие также могут быть причиной гемоконфликта, однако имеют небольшое практическое значение.

Система Резус (Rh – Hr) имеет второе по значимости место. Она состоит из 3 пар антигенов, контролируемых 3 парами аллельных генов. Резус-фактор – активный антиген, способный вызывать образование изоиммунных антител в крови людей, это и определяет практическое значение этой системы.

Антигенная система резус выглядит схематично следующим образом: D – Rh0 – Hr0 – d

C – rh΄ – hr΄ – c

E – rh΄΄ – hr΄΄ – e

В этой системе наиболее активным является антиген Rh0 (прямой резус-фактор). В зависимости от того, присутствует этот фактор или нет, кровь людей разделяется на резус-положительную(Rh D +) и резус-отрицательную (Rh D -). Также значимо определение, так называемых, обратных факторов rh΄ С и rh΄΄Е.

Антитела резус не врожденные, возникают в течение жизни при иммунизации резус-отрицательных людей при переливании или при беременности.

2.2. Методы определения группы крови по системе АВО

При помощи стандартных сывороток

Способ позволяет установить групповые агглютиногены, которые находятся на эритроцитах исследуемой крови.

На планшет возле предварительно маркированных обозначений наносят по одной большой капле (0,1 мл) стандартной сыворотки групп О (I) αβ, А (II) β, В (III) α. Поскольку, используется две серии каждой сыворотки в два ряда, капель получается 6. Седьмая капля сыворотки четвертой группы наносится отдельно в соответствующую лунку. Сыворотку набирают пипеткой из соответствующего флакона, которую тотчас же после использования опускают обратно.

Шесть маленьких капель исследуемой крови (0,01мл) последовательно переносят сухой стеклянной палочкой в лунки, рядом с каплей сыворотки.

Отдельными для каждой группы крови палочками, смешивают сыворотки и каплю крови до гомогенного окрашивания в красный цвет.

После размешивания, планшет покачивают 1-2 мин. Через 3 мин добавляют по капле (0,05 мл) изотонического раствора.

Трактовка реакции происходит через 5 мин. Появившиеся в каждой лунке красные зернышки (агглютинаты), говорят о положительной реакции изогемагглютинации. При отрицательной реакции сыворотка остается равномерно окрашенной. Результаты реакций в каплях одной и той же группы (двух серий) должны совпадать.

а) если сыворотки всех трех групп дали отрицательную реакцию, т.е. смеси остались равномерно окрашенными без признаков агглютинации. То испытуемая кровь не содержит агглютиногенов, т.е принадлежит к группе О (I) αβ;

б) если сыворотки групп О (I) αβ и В (III) α дали положительную реакцию, а сыворотка группы А (II) β – отрицательную, то испытуемая кровь содержит агглютиноген А, т.е. принадлежит к группе А (II) β;

в) если сыворотки групп О (I) αβ и А (II) β дали положительную реакцию, а сыворотка группы В (III) α - отрицательную, то испытуемая кровь содержит агглютиноген В, т.е. принадлежит к группе В (III) α;

г) если сыворотки всех трех групп дали положительную реакцию, это указывает на то, что испытуемая кровь содержит оба агглютиногена А и В, т.е. принадлежит к группе АВ (IV) α. Однако, в этом случае для исключения неспецифической агглютинабельности исследуемых эритроцитов, необходимо провести дополнительное контрольное исследование со стандартной сывороткой группы АВ0(IV). Для этого на пластинку наносят большую (0,1 мл) каплю сыворотки группы АВ(IV) и к ней добавляют маленькую (0,01 мл) каплю исследуемой крови. Перемешивают, после чего наблюдают за результатом в течении 5 минут при покачивании пластинки. Лишь в отсутствие агглютинации в этой капле при наличии ее в каплях, содержащих стандартные сыворотки группы О (I) αβ, А (II) β и В (III) α, можно считать реакцию специфической и отнести исследуемую кровь к группе АВ0(IV).

Определение группы крови перекрестным способом (при помощи стандартных сывороток и стандартных эритроцитов).

1. Под предварительно сделанными обозначениями на пластинку наносят по одной большой капле(0,1 мл) стандартных сывороток групп О (I) αβ, А (II) β, В (III) α, Поскольку используют стандартные сыворотки двух различных серий каждой группы, всего получается 6 капель, которые образуют 2 ряда по 3 капли.

2. На нижнюю часть пластинки также под соответствующими обозначениями наносят по одной маленькой капле(0,01 мл) стандартных эритроцитов в следующем порядке: О (I) αβ, А (II) β, В (III) α.

3. Наносят по большой капле (0,1 мл) сыворотки больного на подготовленные стандартные эритроциты. После, со дна пробирки той же пипеткой набирают эритроциты испытуемой крови и капают по маленькой (0,01 мл) - в 6 точек рядом с каждой каплей стандартной сыворотки.

4. Во всех каплях тщательно сыворотку тщательно перемешивают с эритроцитами, пластинку покачивают периодически через 1-2 мин.

5. Через 3 мин в те капли, где наступила агглютинация, добавляют изотонический раствор. Трактуется результат через 5 мин.

Трактовка проводится путем оценки и сопоставления результатов, полученных при помощи стандартных сывороток (два верхних ряда) и при помощи стандартных эритроцитов (нижний ряд). Результаты должны совпадать, т. е. указывать на содержание агглютининов и агглютиногенов, соответствующих одной и той же группе крови. Эти результаты могут быть выражены в трех различных комбинациях:

а) реакция со стандартными сыворотками (два верхних ряда) указывает на отсутствие групповых агглютиногенов, т.е. испытуемая кровь соответствует О (I) αβ группе. При этом сыворотка испытуемой крови (нижний ряд) дает отрицательную реакцию со стандартными эритроцитами группы О (I) αβ и положительную – со стандартными эритроцитами группы А (II) β и В (III) α. Это указывает на наличие в испытуемой крови агглютининов α и β, т. е. подтверждает принадлежность испытуемой крови к группе О (I) αβ;

б) при помощи стандартных сывороток (два верхних ряда) в испытуемой крови устанавливают наличие агглютиногена А. При этом сыворотка испытуемой крови (нижний ряд) дает отрицательную реакцию со стандартными эритроцитами групп О (I) αβ и А (II) β, но положительную с эритроцитами группы В (III) α. Это указывает на наличие в испытуемой крови агглютинина β, т. е. подтверждает принадлежность испытуемой крови к группе А (II) β;

в) при помощи стандартных сывороток (два верхних ряда) в испытуемой крови устанавливают наличие агглютиногена В. При этом сыворотка испытуемой крови (нижний ряд) дает отрицательную реакцию со стандартными эритроцитами групп О (I) αβ и В (III) α, но положительную с эритроцитами группы А (II) β. Это указывает на наличие в испытуемой крови агглютинина α, т. е. подтверждает принадлежность испытуемой крови к группе В (III) α;

г) при помощи стандартных сывороток (два верхних ряда) в испытуемой крови устанавливают наличие агглютиногенов А и В. При этом сыворотка испытуемой крови (нижний ряд) дает отрицательную реакцию со стандартными эритроцитами всех трех групп. Это указывает на отсутствие в крови агглютининов, т. е. подтверждает принадлежность испытуемой крови к группе АВ (IV);

2.3. Определение резус-принадлежности

Определение резус-фактора при помощи стандартных сывороток анти-резус

Для выявления или отсутствия антигенов системы резус, используют стандартные сыворотки анти-резус, различные по специфичности, т.е. содержащие антитела по отношению к различным антигенам этой системы. Кровь для исследования берется из пальца непосредственно перед исследованием (можно использовать консервированную кровь без предварительной обработки), а также эритроциты из пробирки после образования сгустка и отстаивания сыворотки.

1.Капля стандартной антирезусной сыворотки для экспресс-метода наносится на дно пробирки. Туда же добавляется капля исследуемой крови.

2. Осторожными движениями необходимо добиться, чтобы образовавшийся раствор растекся по стеклу пробирки.

3. Через 3 минуты после внесения эритроцитов добавляется 2-3 мл физиологического раствора.

Пробирка осторожно переворачивается 3 раза, после чего считывается результат:

а) Rh+ - при наличии агглютинатов на фоне просветленной жидкости;

б) Rh- - при гомогенно окрашенной жидкости (отсутствие агглютинации).

Определение резус-фактора при помощи цоликлон анти-D и анти-с супер

Цоликлоны анти-D и анти-с супер выпускается во флаконах 2,5 мл или 10 мл (1 мл содержит 10 доз), срок хранения - 1 год при температуре 2-8°C, вскрытый флакон допускается хранить в холодильнике в закрытом виде в течение 1 месяца. Порядок определения резус-фактора при помощи моноклинального реагента:

1. Нанести на тарелку каплю реагента анти-D (0,1 мл). Поместить рядом маленькую каплю исследуемой крови - 0,01 мл. Смешать исследуемую кровь с реагентом.

2. Через 3 минуты считать результат реакции (агглютинация начинается через 10-15 секунд, четко выраженный вид принимает через 0,5-1 мин).

а) RhD+ - при наличии агглютинатов на фоне просветленной жидкости;

б) RhD- - при гомогенно окрашенной жидкости (отсутствие агглютинации).

3. Нанести на тарелку каплю реагента анти-с (0,1 мл). Поместить рядом маленькую каплю исследуемой крови - 0,01 мл. Смешать исследуемую кровь с реагентом.

3. Через 3 минуты считать результат реакции (агглютинация начинается через 10-15 секунд, четко выраженный вид принимает через 0,5-1 мин).

а) hrc”+ - при наличии агглютинатов на фоне просветленной жидкости;

б) hrc”- - при гомогенно окрашенной жидкости (отсутствие агглютинации).