Распространение микробов в природе

Микробы широко распространены в природе, используя для своего питания различные органические и даже минеральные вещества. Важными факторами, обеспечивающими широкое распространение микроорганизмов во внешней среде, являются их высокая скорость размножения, значительная устойчивость к неблагоприятным факторам внешней среды и высокая приспособляемость к меняющимся условиям обитания. Почва, вода и воздух могут служить источником микробного загрязнения продуктов питания, лекарственного сырья и препаратов, помещений лечебных учреждений, а также источником заражения людей патогенными микроорганизмами. Как правило, представители нормальной микрофлоры почвы, воды и воздуха не являются патогенными для человека. Основными путями попадания патогенных микроорганизмов от больных людей и носителей микробов в окружающую среду являются фекальный и воздушно-капельный.

Точное количественное определение бактерий (в том числе болезнетворных) в воде и других объектах внешней среды (почва, пищевые продукты, лекарственные препараты и др.) представляет значительные трудности в связи с невозможностью создания оптимальных условия для размножения всех встречающихся в исследуемом материале микроорганизмов, а также из-за различий их биологических свойств, низкой концентрацией, временным пребыванием и трудоемкостью исследований. Поэтому о загрязненности внешней среды выделениями человека судят по обнаружению в ней санитарно-показательных микроорганизмов. Эти микробы являются постоянными представителями нормальной микрофлоры организма человека и теплокровных животных, не находятся в других природных резервуарах или не имеют других естественных мест обитания. Санитарно-показательные микроорганизмы сохраняются жизнеспособными в окружающей среде в течение времени, сравнимого со сроками выживания отдельных видов патогенных бактерий, выделяющихся из организма теми же путями, они не способны интенсивно размножаться в окружающей среде и их количество остается постоянным определенный период времени после попадания в окружающую среду. Виды санитарно-показательных микроорганизмы, их количество и биологические свойства доступны для определения с помощью классических микробиологических методов.

Санитарно-показательными микроорганизмами для воды являются Е. coli, S. faecalis; для почвы - Е. coli, S. faecalis, С. perfringens; для воздуха - S. haemolyticus, S. viridans, S. aureus; для предметов обихода - E. coli, S. faecalis, S. аureus. Показателями фекального загрязнения среды служат E.coli, S.faecalis, C.perfringens; показателями орально-капельного загрязнения— S. viridans, S. haemolyticus и S. aureus. Сроки выживания в объектах окружающей среды Е. coli совпадают со сроками выживания патогенных кишечных бактерий. С. perfringens присутствуют в окружающей среде наиболее длительно. Присутствие S. faecalis является показателем свежей фекальной загрязненности. Если С. регfringens обнаруживается без Е. coli, то это свидетельствует о старом фекальном загрязнении среды.

Количественные характеристики микробной загрязненности почвы, воды и других объектов оцениваются по данным определения коли- и перфрингенс-индекса - количества клеток кишечной палочки или С. perfringens в 1 л воды или 1 г почвы.

Микрофлора почвы. Почва, содержащая различные органические соединения, является благоприятной средой для существования многих видов микроорганизмов и главным резервуаром микробов в природе. Из почвы микробы попадают в воду, воздух, на поверх­ность растений, других объектов внешней среды.

В почве содержатся многочисленные виды непатогенных бактерий, актиномицетов, грибов и простейших, а также некоторые болезнетворные микробы (например, палочка газовой гангрены, столбняка, сибирской язвы и др.).

Санитарно-бактериологический анализ почвывключает определение микробного числа, перфрингенс-титра и содержания санитарно-показательных микроорганизмов почвы.

Микробное число почвы — это общее количество микроорганизмов, содержащихся в 1 г почвы. Для его определения, пробы почвы, взятые в асептических условиях, измельчают, растирают и готовят десятикратные разведения (от 1:100 до 1:100 000). Посев выполняют либо в глубину питательного агара (1 мл соответствующего разведения вносят в стерильную чашку Петри и заливают 10 мл расплавленного и охлажденного до 45⁰С МПА или сусло-агара), либо на поверхность питательного агара (0,1 мл соответствующего разведения суспензии распределяют шпателем по поверхности МПА или сусло-агара в чашке Петри). Чашки с сусло-агаром помещают в термостат при 24⁰С (для выявления грибов), чашки с МПА при 37⁰С (для выявления бактерий), инку­бируют 48 ч, после чего подсчитывают количество выросших колоний для каждого разведения почвы, вычисляя затем средний показатель микробного числа почвы.

Для определения коли-индекса почвы используют элективные питательные среды, например, жидкую среду Кесслера, содержащую пептон и лактозу (сбраживается кишечной палочкой с образованием кислоты и газа), а также желчь и краситель генциановый фиолетовый, которые подавляют рост многих почвенных микроорганизмов, но не препятствуют росту кишечной палочки. Для улавливания газа, образовавшегося в результате расщепления лактозы, служат специальные стеклянные «поплавки». После суточной инкубации посевов почвы на среде Кесслера отбирают положительные пробы, характеризующие рост Е.coli в виде диффузного роста и образования газа, скапливающегося в «поплавке». Из этих проб делают высевы на среду Эндо, инкубируют их при 37⁰С 24 ч, отмечая характерные для Е. coli темно-красные колонии с металлическим блеском, из которых готовят мазки и при наличии в них грамотрицательных палочек делают вывод о присутствии Е. coli.

Перфрингенс-титр почвы – наименьшее ее количество в граммах, в котором содержится одна жизнеспособная клетка Cl. perfringens, определяется на железо-сульфитном агаре (среда Вильсона — Блера). Посев почвы производят из дестикратных разведений почвенной суспензии, прогретых при 80⁰ С 10—15 мин с целью инактивации вегетативных форм бактерий. Затем из соответствующих разведений берут стерильной пипеткой по 1 мл суспензии и вносят в пробирку с расплавленной средой Вильсона-Блера. Посев помещают в термостат при 37-43⁰ С. При наличии в пробе Cl. perfringens через 3-18 часов образуется сульфид железа (FeS), окрашивающий колонии этого микроорганизма в черный цвет. При ферментации глюкозы образуются газы, разрывающие среду. Можно использовать также молочные среды, на которых Cl. perfringens энергично сбраживает лактозу, в результате этого молоко быстро (в течение 3—4 ч) створаживается в виде губчатого сгустка, а образующийся при этом газ разрывает сгустки казеина, вытесняя их в верхнюю часть пробирки. Наличие Cl. perfringens в средах подтверждается микроскопическим методом (в мазках, окрашенных по Граму, обнаруживают крупные грамположительные палочки с центрально расположенной спорой, которые могут располагаться цепочками).

Микробиологическая характеристика почвы в зависимости от степени ее загрязненности представлена в табл. 11.

Микрофлора воды. Вода открытых водоемовсодержит различное количество микроорганизмов в зависимости от содержания в ней органических веществ, глубины залегания водоносного слоя и характера грунта. Загрязнение воды открытых водоемов происходит сточными водами и с поверхности почвы, содержащими большое количество различных микробов, включая кишечную палочку. В воду могут попадать болезнетворные микробы, в частности, возбудители кишечных инфекций (брюшного тифа и паратифов, дизентерии, холеры и др.).

Таблица 11. Санитарное состояние почвы по данным микробиологического исследования

Характеристика почвы	Коли-титр	Перфрингенс-титр	Число термофильных бактерий в 1 г. почвы
Чистая Загрязненнная Сильно загрязненная	1,0 и выше	0,01 и выше	102 - 103
0,9 – 0,01	0,009-0,0001	От 103 – 105
0,09 и ниже	0,00009 и ниже	105 – 4х106

Санитарно-бактериологический анализ воды проводится с цельюопределения микробного числа (общего количества мезофильных аэробных и факультативных анаэробных микроорганизмов) в 1 мл воды и содержания санитарно-показательных микроорганизмов.

Для определения микробного числа 1 мл воды вносят в 2 пустые стерильные чашки Петри, в которые наливают 10-12 мл расплавленного при температуре 45⁰С МПА в одну чашку и такое же количество сусло-агара во вторую, перемешивают и после застывания сред культивируют на МПА при 37⁰С 24 ч, а на сусло-агаре для выявления роста грибов 2—3 сут при температуре 24⁰С. Учитывают число колоний микроорганизмов, что соответствует микробному числу воды, которое для питьевой воды централизованного водоснабжения не должно превышать 50 микробных клеток в 1 мл.

Определение кишечных палочек в воде (коли-индекс) проводят с использованием 2 методов - бродильного и мембранных фильтров.

Бродильный (титрационный) метод используют только при отсутствии возможности применения метода мембранных фильтров, наличии в воде большого количества взвешенных веществ и преобладании посторонних бактерий, что затрудняет рост на мембранных фильтрах изолированных колоний. Анализ воды с помощью двухэтапного бродильного метода проводят в трех параллельных рядах, начиная с 10; 1 и 0,1 мл. Для объемов 10 мл используют флаконы по 100 мл лактозо-пептонной среды, все остальные объемы воды вносят в пробир­ки с 5 мл питательной среды. Водопроводная вода исследуется в трех объемах по 100 мл воды, трех - по 10 мл воды и трех - по 1 мл. Культивирование посевов производят при 380С в течение 24 ч. В случае отсутствия помутнения среды и образования газа через сутки дается отрицательный ответ. При наличии помутнения среды кислоты и газа из такого флакона производят посев на сектора чашки со средой Эндо. Если через 16-18 ч на среде вырастают темно-красные с металлическим блеском или колонии без блеска, из них готовят мазки и проводят пробу на оксидазу (снимают по 2-3 ко­лонии и наносят на фильтровальную бумагу, смоченную диметил-пара-фенилендиамином; кишечная палочка оксидазой не обладает, поэтому изменения цвета фильтровальной бумаги не происходит). Наличие в мазках грамотрицательных палочек и отсутствие оксидазы свидетельствует о положительном результате исследований, которые выражают в виде коли-индекса (количество кишечных палочек в 1 л воды). Для питьевой воды централизованного водоснабжения коли-индекс не должен быть больше трех.

Для определения коли-индекса воды методом мембранных фильтров фильтруют воду в объеме от 300 до 500 мл, помещая затем фильтр на поверхность среды Эндо. Чашки с фильтрами инкубируют при 370С в течение 18-24 ч. Количество темно-красных колоний с металлическим блеском на фильтре, в которых при микроскопическом исследовании находят грамотрицательные палочки, соответствует коли-индексу при перерасчете показателя на 1 литр воды. Для водопроводной воды коли-индекс составляет 2.

Другим санитарно-показательным микроорганизмом, свидетельствующем о фекальном загрязнении воды, является энтерококк (Streptococcus faecalis). Индекс энтерококков в исследуемой воде определяют в параллельных рядах посевов в жидкой щелочно-полимиксиновой среде с 10-кратными разведениями в зависимости от предполагаемого бактериального загрязнения воды от 100 до 0,01 мл. Объемы воды по 100 и 10 мл вносят в щелочно-полимиксиновую среду двойной конце­нтрации, остальные объемы — в пробирки со средой обычной концентрации, учет производят после 24 ч инкубации при 37 °С по изменению цвета и помутнению среды. Из этих флаконов проводят высев на сектора чашки с молочно-ингибиторной средой. Фекальный стрептококк растет на секторах чашек в виде черных колоний с металлическим блеском.

Микрофлора воздуха. Воздух не является благоприятной средой для обитания микробов, попадающих в него из почвы, воды, организма человека и животных, существуя в нем ограниченный промежуток времени. В воздухе найдены сапрофитные спорообразующие бактерии, стафилококки, сарцины, споры грибов, а также некоторые патогенные виды микробов, выделяемые человеком через верхние дыхательные пути при воздушно-капельных инфекциях (грипп, респираторные инфекции, коклюш, дифтерия и др.).

Санитарно-бактериологическое исследование воздуха. Включает определение микробного числа воздуха и санитарно-показательных микроорганизмов.

Микробное число воздуха определяется обычно аспирационным методом с помощью аппарата Кротова (рис.33, см. приложение) со скоростью просасывания воздуха не менее 25 л/мин. В аппарате Кротова воздух засасывается через щель, ударяясь о поверхность питательной среды в чашке Петри. В качестве питательной среды для определения микробного числа пользуются мясо-пептонным агаром, а для определения санитарно-показательных микроорганизмов применяются специальные питательные среды (для выявления золотистого стафилококка - желточно-солевой агар, стрептококков - кровяной МПА, среда Гарро - кровяной МПА с генциан-виолетом, среда Туржецкого - сахарный МПА с кровью и генциан-виолетом). Преимуществом этого метода является возможность посева определенного объема воздуха. Для определения общего числа бактерий количество пропущенного воздуха составляет 100 л, для выявления санитарно-показательных микроорганизмов (золотистого стафилококка), дрожжевых и плесневых грибов - 250 л. Для определения роста сапрофитных бактерий используют МПА, грибов - сусло-агар и агар Сабуро, золотистого стафилококка — желточно-солевой агар. В каждом помещении аптеки посев делают на 5-10 чашек Петри с МПА и желточно-солевым агаром. Посевы помещают в термостат при 37⁰С на 24 ч, после чего выдерживают 24 ч при комнатной температуре; посевы на среде Сабуро выращивают при 22—28⁰С 4 сут. Затем подсчитывают количество выросших колоний и производят пересчет на 1 м³ воздуха. Идентификацию золотистого стафилококка, выросшего на желточно-солевом агаре проводят по общепринятым тестам.

В качестве ориентировочного метода оценки микрофлоры воздуха может использоваться седиментационный метод.

Для этого чашки Петри с плотной пита­тельной средой открывают в местах отбора проб воздуха, выдерживая в течение 5-30 мин, после чего чашки закрывают и помещают их в термостат. По количеству выросших колоний подсчитывают микробное число воздуха, пользуясь правилом Омелянского, в соответствии с которым считают, что на поверхность питательной среды площадью 100 см2 в течение 5 мин оседает столько микроорганизмов, сколько их содержится в 10 л воздуха. Каждая микробная клетка дает начало одной колонии. Зная количество выросших колоний и время экспозиции, вычисляют количество микробов, содержащихся в 1 м3 (1000 л) воздуха.

Допустимые нормы микробного числа воздуха различных больничных помещений представлены в табл. 12.

Таблица 7. Показатели микробной обсемененности воздуха в больничных помещениях

Место отбора проб	Микробное число	Содержание S.aureus
Операционные До начала работы Во время работы	Не более 500	Не допускается
Не более 1000	Не допускается
Не более 1000	Не допускается
Родильные комнаты	Не более 1000	Не допускается
Палаты для недоношенных детей	Не более 750	Не допускается

В последнее время для определения микрофлоры воздуха разработаны более совершенные приборы – импакторы (рис. 34, см. приложение).

Анализ микробной загрязненности столов, оборудования, посуды, полотенец, халатов, рук персонала. Санитарно-бактериологическому анализу подвергаются смывы со столов, оборудования, полотенец, халатов и рук медицинских работников. Эти исследования направлены на проверку соблюдения правил санитарного режима. Кроме определения микробного числа, исследуют состав микрофлоры на наличие Е. coli, энтерококков, энтеровирусов, S. aureus, синегнойной палочки и бактерий рода Proteus, а при необходимости - патогенных микроорганизмов.

При проведении этих анализов используется 2 метода - тампонов и смывов.

Первый метод проводится с помощью стерильных ватных тампонов,погруженных в пробирки с 2 мл 0,1% пептонной воды или изотонического раствора хлорида натрия. Тампон не должен касаться поверхности жидкости и его смачивают непосредственно перед взятием проб.

Для отбора проб с поверх­ностей (например, столы) используют трафареты из проволоки или жести, которые предварительно стерилизуют обжиганием в пламени горелки; затем накладывают их на поверхность стола и производят смыв влажным тампоном (салфеткой) с поверхности 100 см², ограниченной трафаретом. Тампон помещают в пробирку, добавляют 8 мл жидкости и тщательно прополаскивают, отжимая тампон. Общую микробную загрязненность определяют путем посева 1 мл смыва в глубину расплавленного МПА в чашке Петри. Посевы выращивают сутки при 37°С, подсчитывают количество выросших колоний и определяют общую микробную загрязненность объекта. Для выявления грибов выполняется посев на сусло-агар или агар Сабуро. Смывы с рук работников получают, протирая ладони, межпальцевые и подногтевые пространства влажным стерильным тампоном. В пробирку со смывом наливают 5 мл среды Кесслера или Булира (для накопления Е. coli) и помещают пробирки в термостат при температуре 43⁰ С. На следующий день при наличии роста делают пересев на дифференциально-диагностическую среду Эндо. При появлении на ней типичных темно-красных колоний производят микроскопию и ставят оксидазную пробу. На основании результатов этих тестов делают вывод о наличии кишечной палочки. Для обнаружения золотистого стафилококка засевают смыв петлей штриховым методом на чашки Петри с желточно-солевым агаром. Идентификацию золотистого стафилококка проводят по общепринятым тестам.

Для получения смывов с посуды наливают 10 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия в исследуемую склянку или флакон, тщательно встряхивают, ополаскивают всю внутреннюю поверхность и делают посев 1 мл смыва в МПА или сусло-агар по вышеописанной методике.

Санитарно-бактериологическое исследование напитков (лимо­над, минеральные воды) - демонстрация. Определяют микробное число и БГКП, ис­пользуя при этом методы, применяемые для исследования пи­тьевой воды. Перед проведением исследования лимонад нейтрализуют 10 % раствором гидрокарбоната натрия, прове­ряя реакцию среды с помощью лакмусового индикатора. Ото­бранные пробы минеральной воды выдерживают при 43⁰ С в течение 1 ч для удаления избытка газа. Коли-титр определяют методом мембранных фильтров. С этой целью 500 мл напитка фильтруют через мембранные фильтры (100 мл через 1 фильтр), после чего последние промывают стерильной водой для удале­ния остатков минеральных солей и помещают на поверхность среды Эндо. Посевы инкубируют при 37⁰ С, после чего определяют БГКП. Демонстрацию описать, зарисовать.

Санитарно-бактериологические нормативы для лимонада, кваса, фруктово-ягодных безалкогольных напитков и минеральных вод должны соответствовать нормативам питьевой водо­проводной воды.

Санитарно-бактериологическое исследование мяса, колбасных изделий и мясных продуктов - демонстрация. Определяют количество бактерий в окрашенных по Граму мазках-отпечат­ках из кусочков мяса размером 2х1,5х2,5 см. Норматив для свежего мяса - не более 10 бактериальных клеток в поле зрения.

Бактериологическое исследование мяса и мясных продуктов включает определение количества МАФАМ, БГКП, сальмонелл, бактерий рода Proteus, коагулазоположительных стафилококков и клостридий. Анализ поверхностных и глубинных участков продукта проводят не позднее чем через 4 ч с момента отбора проб. При иссле­довании глубинных участков образцы продукта предварительно обрабатывают спиртом и обжигают. К навескам продукта мас­сой 20 г добавляют 80 мл стерильного физиологического раствора и гомогенизируют в ступке или электрическом гомогенизаторе. Для определения общего количества микробов в 1 г продукта делают посев 0,1 и 0,01 г продукта на питательный агар мето­дом пластинчатых разводок Коха, инкубируют 48 ч и подсчи­тывают число колоний. Для определения бактерий группы кишечной палочки в 1 г продукта производят посев 5 мл взвеси на элективно-дифференциальную среду Кесслера, инкубируют в течение 18—20 ч. с последующим пересевом на среду Эндо. Определение сальмонелл проводят в навеске продукта не менее 25 г. Делают посев разведения навески в 100 мл среды обога­щения (селенитовый бульон и магниевая среда), инкубируют в течение 24 ч., после чего делают высев на висмут-сульфит агар

При наличии Proteus spp. наблюдается ползучий рост. В мазках выявляют грамотрицательные палочки, определяют их подвижность и идентифицируют культуру бактерий.

Для определения коагулазоположительных стафилококков проводят посев 0,2 мл взвеси продукта на желточно-солевой агар, инкубируют посевы при 37⁰ С и при комнатной температуре. При обнаружении стафи­лококков проводят их идентификацию.

Для обнаружения анаэробных спорообразующих бактерий Clostridium perfringens делают посев 10-кратных разведении взвеси в сульфитциклосериновую среду (СЦС) и среду Вильсона—Блера. Посевы инкубируют при 46⁰ С в течение 12 ч; при наличии C.perfringens наблюдается почернение среды. При положитель­ном результате посева разведения 10 ^-1 считается, что в 1 г продукта содержится 10 клеток соответствующих бактерий; разведения 10 ^-2 — 100 клеток и т.д. Демонстрацию описать, зарисовать.

Колбасные изделия и продукты из мяса в соответствии с действующими нормативами не должны содержать бактерии группы кишечной палочки при исследовании 1 г продукта, сальмонелл в 25 г, бактерий рода Proteus и сульфитредуцирующих клостридий 0,1 г; микробное число не должно превышать 10³.

Санитарно-бактериологическое исследование консервов - демонстрация. В консервах определяют наличие аэробных и анаэробных бактерий, при необходимости (по эпидемиологическим показаниям) - Clostridium botulinum и ботулинического токсина. Перед бактериологическим исследованием консервную банку проверяют на герметичность в сосуде с горячей водой, ставят контроль на бомбаж, выдер­живая в термостате при 37 "С в течение 5 суток, после чего моют теплой водой, высушивают, протирают спиртом и обжигают верхнюю крышку смоченным спиртом горящим ватным там­поном. Содержимое банки засевают для выяв­ления аэробной флоры в две пробирки с бульоном, а для обнаружения анаэробной микрофлоры — в две пробирки со средой Китта—Тароцци. Посевы инкубируют при 37⁰ С в течение 5 суток. При наличии роста аэробные бактерии пересевают на питательный агар, среду Эндо, скошенный агар (по Шукевичу) и на питательный агар с 1 % глюкозы. Из среды Китта—Тароцци берут 1—2 мл, вносят в чашки Петри и заливают расплавленным и охлажден­ным до 45-48⁰ С питательным агаром с 1 % глюкозы. После застывания на поверхность среды помещают стерильное предметное стекло (для создания анаэробных условий). Посевы инкубируют в течение 1 суток при 37⁰ С. Из выросших колоний получают чистую культуру, которую затем идентифицируют по общепринятой схеме.

Для выявления ботулинического токсина исследуемые про­бы консервов фильтруют и с фильтратом ставят реакцию ней­трализации токсина с антитоксическими противоботулиническими сыворотками типов А, В, С, Е, F на белых мышах или обнаруживают присутствие токсина с помощью других сероло­гических реакций (РНГА, иммуноферментный анализ). В консервах не допускается присутствия C.botulinum и его токсина, С.регfringens и других патогенных бактерий.

Присутствие аэробной неспорообразующей флоры указыва­ет на недостаточную эффективность примененных методов консервирования и возможность порчи. Присутствие сапро­фитных аэробных бацилл {B.subtilis, B.mesentericus) является до­пустимым при герметичности и отсутствии бомбажа консерв­ных банок.