Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ)

Известны вещества, оказывающие на лимфоциты млекопитающих митогенное действие (табл. 1).

Таблица 1

Неспецифические митогены лимфоцитов

Чаще для оценки функционального состояния Т-лимфоцитов в клинической лабораторной практике используют фитогемагглютинин (ФГА) – растительный лек­тин, получаемый из семян фасоли. Обычно мононуклеарные лейкоциты, выделен­ные из периферической крови методом градиентного центрифугирования, культи­вируют в присутствии ФГА в течение 72 ч. Результаты реакции можно учитывать либо морфологическим методом, либо по включению радиоактивной метки.

В первом случае из клеточной культуры готовят мазки, фиксируют их в мета­ноле и окрашивают по Романовскому-Гимза, так же, как мазки крови. В световом микроскопе с иммерсионной системой определяют процент бластов по отношению к общему количеству лимфоцитов. Результат может быть выражен также в виде ин­декса стимуляции (ИС), представляющего собой отношение процента трансформи­рованных клеток в опыте (культура с ФГА) к проценту трансформированных клеток в контроле (культура без ФГА).

Учет результатов по включению радиоактивной метки более удобен. Этот ме­тод позволяет уменьшить количество крови для исследования, а также сократить расход питательных сред и трудозатраты. Культивирование проводят не в пробир­ках или флаконах, а в 96-луночных планшетах с объемом лунки около 200 мкл. В каждую лунку достаточно внести 50000 клеток, что в пересчете на цельную кровь составляет 0,05 мл. За 4-6 ч до окончания культивирования в лунки вносят зН-ти­мидин. Далее с помощью специального прибора (клеточного харвестера) клетки пе­реносят на стеклянные фильтры, избыток метки смывают большим количеством воды, фильтры высушивают и помещают во флаконы со сцинтилляционной жид­костью. Уровень включения метки оценивают на сцинтилляционном спектрофото­метре. Результаты выражают в импульсах в минуту или в виде индекса стимуляции (отношение уровня включения метки в культуре с ФГА к уровню включения метки клетками, культивировавшимися без ФГА).

На интенсивность стимуляции лимфоцитов могут влиять условия культивиро­вания, качество использованных реактивов, качество сыворотки, используемой в ка­честве добавки к питательной среде.

При оценке результатов РБТЛ следует обращать внимание, как на интенсив­ность пролиферативного ответа стимулированной культуры, так и на высоту ответа в контрольных лунках. Снижение пролиферативного ответа на ФГА свидетельст­вует о наличии иммунодефицита, однако механизмы последнего могут быть раз­личны.

Оценка интенсивности продукции цитокинов

С помощью тестов этой группы можно получить представление о продукции цитокинов мононуклеарными лейкоцитами периферической крови. Следует иметь в виду, что одни цитокины продуцируются преимущественно лимфоцитами (ИЛ-2, ИЛ-6), а другие – моноцитами (ИЛ-1, TNF); продукцию первых стимулируют Т-клеточные митогены (ФГА, Кон А), продукцию вторых – микробные липополисахариды (ЛПС).

Исследование проводят по следующей схеме. Мононуклеары периферической крови, выделенные методом градиентного центрифугирования, культивируют в 24-луночных культуральных планшетах (объем лунки около 2 мл) в течение 16-18 ч в присутствии Кон А, ФГА или ЛПС. Надосадочную жидкость собирают и опреде­ляют в ней содержание цитокина. Для определения содержания цитокинов исполь­зуют либо иммуноферментный анализ, либо цитокинзависимые клеточные линии. Принцип определения основан на том, что клеточная линия способна размножаться только в присутствии определенного цитокина. Интенсивность пролиферации кле­ток линии в присутствии разных разведений исследуемого образца сравнивают с интенсивностью пролиферации клеток той же линии в присутствии различных разведений рекомбинантного цитокина с известной активностью. Математическое сравнение полученных титровочных кривых позволяет вычислить содержание цитокина в исследуемом образце. В некоторых случаях используют не цитокинзависимую, а цитокинчувствительную клеточную линию. Клетки этой линии гибнут в присутствии цитокина. Таким образом, титровочная кривая будет отражать процент погибших клеток, которых будет тем больше, чем выше концентрация цитокина.

Определение специфических IgE обычно проводят с помощью кожных проб. Определение специфических IgE с помощью радиоаллергосорбентного теста показано при высоком риске анафилактических реакций, поражении кожи. Суть метода заключается в следующем:

1) к аллергену, сорбированному на твердой подложке, добавляют исследуемую сыворотку;

2) после отмывания несвязавшихся IgE добавляют меченые антитела к IgE;

3) по уровню радиоактивности оценивают содержание специфических IgE в исследуемой пробе.

Применяется модификация метода с использованием меченных ферментом антител к IgE.

Методы, основанные на реакции высвобождения гистамина тучными клетками. Суть методов заключается в следующем:

1) к тучным клеткам, покрытым специфическими IgE, добавляют антиген;

2) связывание антигена с IgE вызывает дегрануляцию тучных клеток и высвобождение гистамина;

3) определяют содержание гистамина в растворе.

Эти методы могут использоваться для изучения влияния лекарственных средств и других веществ на тучные клетки и базофилы при аллергических заболеваниях. Методы, основанные на реакции высвобождения гистамина тучными клетками, трудоемки и применяются редко.