Флуориметр Water-PAM

В работе используется импульсный флуориметр WaterPAM (Walz, Германия). Watеr-PAM служит для измерения различных параметров флуоресценции и их световых зависимостей. Процедура измерения фотохимического и нефотохимического тушения флуоресценции на флуорометре приведена на рисунке 3. Сначала измеряется уровень F₀ у выдержанного в темноте образца при открытых реакционных центрах. Затем подается один импульс насыщающего света 0,8 с, который закрывает реакционные центры и убирает фотохимическое тушение. При этом режиме регистрируют максимальную флуоресценцию F_m. Эти два уровня задают максимальную величину переменной флуоресценции F_v = F_m – F₀. Через некоторый интервал времени включается постоянный действующий свет, который индуцирует изменения выхода флуоресценции, характерные для обычной индукционной кривой флуоресценции хлорофилла F_(t). При этом на всем протяжении индукционной кривой переменная величина F_(t) остается меньше, чем F_m. Разница между F_m и F_(t) характеризует общее тушение флуоресценции, которое развивается под действием постоянного света. Общее тушение складывается из фотохимического и нефотохимического тушения. Во время действия насыщающей вспышки фотохимическое тушение снимается, и флуоресценция возрастает до значения F_m'. Однако, значение F_m' остается меньше, чем F_m. Так как в обоих случаях фотохимическое тушение отсутствует, разница между (F_m-F_m') характеризует величину нефотохимического тушения, индуцированного постоянным освещением. Соответственно, разница (F_m' – F_(t)) характеризует величину фотохимического тушения и пропорциональна количеству фотосинтетически активных центров ФС2 на этом свету.

Рис. 3. Принцип регистрации разных параметров флуоресценции, в том числе величин фотохимического (qP) и нефотохимического тушений (qN, NPQ) при постоянном освещении на флуориметре. F₀ и F_m – постоянная и максимальная флуоресценция у адаптированного к темноте листа при одиночном освещении односекундным импульсом мощного белого света; F₀' и F_m' – постоянная и максимальная флуоресценция после продолжительного освещения; F_(t) – квазистационарный уровень флуоресценции у адаптированного к свету листа; Светлые стрелки–включение и выключение измеряющего модулированного света, жирные темные стрелки – соответственно начало и конец непрерывного освещения, тонкие темные соответствует коротким вспышкам света насыщающей интенсивности.

На свету проводятся измерения быстрых световых зависимостей различных параметров флуоресценции при последовательном увеличении интенсивности от 0 до 900 μЕ/(м²с). Протокол измерения световых кривых показан на рисунке 4.

Рис. 4. Принцип регистрации световой кривой флуоресценции на импульсном РАМ флуориметре. Интенсивность действующего света приведена в μЕ/м²с.

Время освещения при каждой интенсивности составляет 30 секунд. При таких временах освещения быстрые переходные процессы, связанные с изменением интенсивности, заканчиваются и световые зависимости близки к таковым, регистрируемым при длительном стационарном освещении. В конце каждого сеанса освещения измеряется выход флуоресценции хлорофилла F_(t), а также параметры F_m' с использованием насыщающей вспышки (0.8 с, 2000 μЕ/(м²с). На основании всех параметров определяется квантовый выход фотохимического превращения поглощенной световой энергии в ФС 2 как отношение Y= (F_m'-F_t)/F_m', нефотохимическое тушение флуоресценции NPQ=(F_m-F_m')/F_m и относительная скорость нециклического электронного транспорта при данной интенсивности света (rETR). Скорость транспорта электронов рассчитывается по формуле rETR = Y·E_i, где E_i – освещенность, μЕ/(м²с). На основании полученных световых кривых оценивают следующие фотосинтетические параметры: коэффициент максимальной утилизации световой энергии (угол наклона световых кривой, α), максимальную относительную скорость электронов по электрон транспортной цепи (rETR_max) и насыщающую интенсивность света (Е_н). α рассчитывают как коэффициент линейной регрессии, построенной по точкам, лежащим на светолимитированном участке световых кривой, rETR_max – как среднее по значениям rETR, находящимся на светонасыщающем участке. Е_н рассчитывают по формуле Е_н = rETR_max / α. Обозначения и определения фотосинтетических параметров приведены в соответствии с общепринятой номенклатурой.

10) Построить графики по световым зависимостям параметров флуоресцеции (F_t, F_m’, Yield, qN, NPQ, rETR) и рассчитать параметры световой кривой относительной скорости нециклического электронного транспорта (коэффициент максимальной утилизации световой энергии (угол наклона световых кривой, α), максимальную относительную скорость электронов по электрон транспортной цепи (rETR_max) и насыщающую интенсивность света (Е_н).

11) Построить и рассчитать параметры индукционных кривых флуоресценции (расчет по JIP-тесту).

12) Построить кривые замедленной флуоресценции и окисления Р_700, полученные на приборе М-РЕА2.

13) Применение различных программных пакетов для обработки полученных результатов.

14) Выводы по проделанной работе;