Разделение аминокислот методом хроматографии на бумаге

Разделение аминокислот методом хроматографии на бумаге проводится с целью идентификации аминокислот, находящихся в растворе.

Определение свободных аминокислот важно для изучения обмена белков в организме. В норме в плазме крови и в моче содержится определенное количество аминокислот. При нарушении функции отдельных органов или физиологических систем (недостаточная функция печени, усиленный распад белков, ослабление выделительной функции почек и т.д.) в сыворотке, а иногда и в моче наблюдаются изменения в содержании аминокислот и в аминокислотном составе.

Метод основан на различной растворимости отдельных аминокислот в двух частично смешивающихся жидкостях, одной из которой является вода, другой – водонасыщенный органический растворитель (смесь бутилового спирта с уксусной кислотой). Водная фаза неподвижна, так как в данном случае вода сорбирована на инертном носителе – целлюлозе, которая в насыщенной влагой атмосфере (хроматографической камере) удерживает до 20% воды, оставаясь внешне сухой; подвижной фазой является насыщенный водой органический растворитель. Чем больше растворимость аминокислоты в водной фазе и меньше – в органическом растворителе, тем медленнее движется аминокислота по бумаге с органическим растворителем. По ходу передвижения растворителя смесь аминокислот будет разделяться, причем те из них, которые растворяются в органическом растворителе лучше, продвигаются вдоль бумаги дальше, те же, которые растворяются в нем хуже, делают более короткий путь. Поэтому местоположение вещества на хроматограмме зависит от его коэффициента распределения - ά:

В распределительной хроматографии важен подбор такого органического растворителя (подвижная фаза), при котором различны значения " ά " для отдельных компонентов смеси.

В свою очередь от " ά " зависит коэффициент скорости движения – Rf (retention factor – фактор удерживания), который легко определить практически:

Rf данного вещества зависит не только от качества растворителя (его состава, рН), но и от температуры среды и качества используемой бумаги (плотность, толщина и др.). Поэтому очень важно хроматографию проводить при определенной и постоянной температуре (20-22°) и пользоваться только предназначенной для хроматографии бумагой.

Rf является характерной величиной для каждой аминокислоты и постоянен для данных условий опыта. Поэтому им широко пользуются при идентификации веществ при их анализе методом распределительной хроматографии на бумаге. Для этого сравнивают Rf аминокислот исследуемой смеси с Rf известных стандартных аминокислот.

Основные преимущества хроматографического метода – простота, точность данных при незначительных количествах исследуемых веществ (десятые и сотые доли миллиграмма), быстрота и возможность одновременно проводить большое количество анализов.

Ход работы: Для разделения смеси аминокислот вырезают полоску хроматографической бумаги длиной 15-16 см и шириной 1,5 см, в зависимости от величины хроматографической камеры, в которой проводится хроматографирование. В качестве хроматографической камеры могут использоваться большие пробирки, стеклянные цилиндры. Хроматографическую бумагу, можно брать только пинцетом. Один из концов полоски "заостряют", отрезая от него кусочки ножницами, и на нем проводят простым карандашом линию на расстоянии 2 см от края. Этот конец бумаги зажимают между двумя стеклянными пластинками и проводят стеклянной палочкой, смоченной раствором смеси аминокислот, по начерченной линии. После подсыхания полоски вновь наносят порцию аминокислот. Эту процедуру повторяют 3-4 раза.

На дно хроматографической камеры осторожно, не смачивая стенок, наливают из пипетки 1-2 мл смеси бутанола, уксусной кислоты и воды (4:1:5).

Конец хроматограммы, где не нанесена смесь аминокислот, прикрепляют с помощью иголки к пробке, которой плотно закрывают хроматографическую камеру, при этом заостренный конец хроматограммы должен быть погружен в растворитель на 1 см, полоска со смесью аминокислот не должна касаться растворителя, (рис.1). Хроматографирование проводят в течение 1,5-2 часов. За это время проявитель пройдет по хроматограмме путь снизу вверх, равный примерно 10 см. Затем хроматограмму вынимают из камеры, отмечают границу фронта продвижения растворителя (делают надрезы ножницами слева и справа) и высушивают под тягой. На высушенную хроматограмму наносят с помощью пульверизатора 0,5% раствор нингидрина в ацетоне так, чтобы вся хроматограмма была равномерно (без подтеков) смочена раствором. Как только ацетон испарится, хроматограмму помещают в сушильный шкаф при температуре 70°С на 15 минут. Отдельные аминокислоты обнаруживаются в виде цветных (синих или фиолетовых) пятен, расположенных на разных расстояниях от места нанесения исследуемой смеси.

На хроматографической бумаге наблюдают нингидриновую реакцию (лабораторная работа №1).

Рис.1. Упрощенный прибор для распределительной хроматографии на бумаге: 1-пробка; 2-иголка; 3-фронт растворителя; 4-пробирка; 5-полоска хроматографической бумаги; 6-место нанесения смеси аминокислот, очерченное карандашом; 7-растворитель.

Идентификацию аминокислот осуществляют по значению Rf. Для этого измеряют с точностью до миллиметра расстояние, пройденное проявителем от линии нанесения аминокислот до границы фронта проявителя. С такой же точностью измеряют расстояние от точки нанесения аминокислот до центра цветного пятна. Путем деления величины пути, пройденного аминокислотой на хроматограмме, на величину пути, пройденного проявителем, находят значение коэффициента Rf.

Таким же образом вычисляют Rf для стандартных известных аминокислот (хроматограммы с известными аминокислотами ставятся параллельно). И сравнивая Rf известных аминокислот с Rf аминокислот смеси, определяют последние.

ЗНАЧЕНИЯ Rf АМИНОКИСЛОТ (при температуре 20°С)