Расщепление ДНК с помощью рестриктаз

Для фрагментирования используют рестриктазы (ферменты, расщепляющие ДНК) или рестрикционные эндонуклеазы (от англ, restriction endonucleases), выделенные из бактериальных клеток. Эти ферменты in vivo участвуют в узнавании и разрушении чужеродных для бактерий ДНК, расщепляя внутренние участки молекулы на сравнительно небольшие фрагменты. Рестриктазы узнают специфические последовательности из 4-6, реже 8-12 нуклеотидов в двухцепочечной молекуле ДНК (сайты рестрикции) и "разрезают" её в местах локализации этих последовательностей. Количество образующихся рестрикцион-ных фрагментов ДНК при использовании одной рестриктазы зависит от количества сайтов рестрикции, а размер фрагментов определяется положением этих сайтов по всей длине исходной молекулы ДНК.

Известно более 500 различных типов рестриктаз бактериального происхождения, причём каждый из этих ферментов узнаёт свою специфическую последовательность (рис. 4-.62). С помощью набора рестриктаз можно разрезать молекулу ДНК на фрагменты желаемой длины. Например, для изучения первичной структуры (метод секвенирования) удобны фрагменты размером около 300 пар нуклеотидов. Следовательно, ДНК одной хромосомы в 150×10⁶ пар нуклеотидов нужно разрезать на 500 000 фрагментов и каждый из фрагментов изучать отдельно.

Образующиеся в результате рестрикции фрагменты ДНК могут быть исследованы методом электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле. Выявление ДНК в геле возможно в присутствии бромида этидия, связывающегося с фрагментами молекулы и дающего специфическое розовое окрашивание в ультрафиолетовой области спектра.

Рис. 4-62. Последовательность нуклеотидов в ДНК, узнаваемая тремя наиболее часто используемыми рестриктазами. Рестрикцирующие нуклеазы получают из различных бактерий: НРА I - Haemophilus parainfluenzae; Eco RI - из Escherichia coir, Hind III - из Haemophilus influenzae. Рестриктазы типа 1 расщепляют ДНК с образованием "слепых" концов, а другие (типа 2) с образованием по месту разрыва одноцепочечных "липких" концов.

Б. Идентификация специфических последовательностей

При обработке геномной эукариотической ДНК, в частности, ДНК человека, рестриктазами образуется так много фрагментов различной длины, что их не удаётся удовлетворительно разделить с помощью электрофореза в полиакриламидном или агарозном геле. После электрофореза рестрикцированной геномной ДНК и проявления с помощью бромида этидия получается равномерное окрашивание по всей длине геля. Идентификация нужных фрагментов ДНК в таком геле возможна только путём гибридизации с мечеными ДНК-зондами. Синтез ДНК-зондов осуществляется в автоматизированных машинах, позволяющих синтезировать фрагменты однонитевой ДНК длиной свыше 100 нуклеотидных звеньев со строго определённой первичной структурой. Такие молекулы можно использовать для специфического связывания с исследуемыми участками гена.