Тема: | Кинетика ферментативных реакций Регуляция активности ферментов |
Цель работы: | - Овладение методами кинетики ферментативных реакций: расчет значений констант Михаэлиса и максимальных скоростей реакций методом двойных обратных величин - Изучение характера ингибирующего действия ацетилхолина на реакцию гидролиза ацетилтиохолина под действием ацетилхолинэстеразы |
Оборудование и материалы:
· Спектрофотометр SOLAR
· Кюветы стеклянные
· Термостат
· Пробирки
· Штативы для пробирок
· Колбы на 100-250мл
· Стакан на 300 мл
· Автоматические микропипетки
· палочки стеклянные
· Бумага миллиметровая
Реактивы:
· Амилаза бактериальная
· Крахмал, 0.25% раствор
· Раствор Люголя (йод, 1% раствор в KJ, 2,5%)
· Сульфат меди (CuSO4), 2% раствор
· Хлорид натрия (NaCl), 1% раствор
· Натрий-фосфатный буфер, 0,1 М рН 7,40
· Мембраны эритроцитов
· Ацетилтиохолин, 1мМ раствор в натрий-фосфатном буфере
· Ацетилхолин, 5мМ раствор в натрий-фосфатном буфере
· Реактив Эллмана
· Вода дистиллированная
|
|
Теоретическая часть
Влияние концентрации субстрата на активность фермента
Начальная скорость ферментативной реакции, обозначаемая символом Vо (скорость, измеряемая за период, когда израсходована небольшая доля субстрата) увеличивается по мере роста концентрации субстрата [S] в реакционной смеси. При неизменности остальных условий реакции (концентрации фермента [Е], концентрации кофакторов, температуры) скорость превращения субстрата в продукт увеличивается до определенного значения, называемого максимальной скоростью реакции, V max, которая далее остается постоянной.
Рис. 6.1 Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата.
Начальная скорость ферментативной реакции, Vо, увеличивается с ростом концентрации субстрата до тех пор, пока не наступит состояние насыщения фермента субстратом. Начальная скорость, измеренная в условиях насыщения, уже не зависит от дальнейшего повышения концентрации субстрата. В ферментативной кинетике обычно используют значительный молярный избыток субстрата по сравнению с концентрацией фермента. Например, если фермент с молекулярной массой 100.000 взаимодействует с субстратом с молекулярной массой 100 и оба компонента присутствуют в реакционной смеси в концентрации 1 мг/мл, каждый, то на один моль фермента будет приходиться 1000 молей субстрата. В клетке наиболее реальными являются следующие численные значения концентраций фермента и субстрата: [E] = 0,1 мкг/мл = 10 – 9 М, [S] = 0,1 мг/мл = 10 – 3 М, т.е. молярный избыток субстрата по отношению к ферменту составляет 106. Даже при уменьшении [S] в 100 раз, его концентрация все еще будет 10.000-кратно превышать концентрацию фермента.
|
|
Точкам А, В и С на графике, изображенном на рис. 6.1, соответствуют ситуации А, В и С, приведенные на рис. 6.2.
Рис. 6.2 Схема, поясняющая взаимодействие субстрата с ферментом при низкой (А) и высокой (С) концентрации субстрата, а также при концентрации субстрата, равной величине Km (В). Состояния А, В и С соответствуют точкам А, В и С, указанным на кривой рис. 6.1.
Несмотря на то, что молекул субстрата в реакционной смеси намного больше, чем молекул фермента, в точках А и В (рис. 6.1) в связывании субстрата принимает участие небольшая часть молекул фермента. Это происходит по той причине, что константа равновесия реакции взаимодействия субстрата с ферментом E + S «ES (т.е. образование фермент-субстратного комплекса ES) хотя и велика, но конечна. Таким образом, в точках А и В повышение или понижение [S] будет приводить к увеличению или уменьшению доли молекул E, связанных с S (т. е. доли комплексов ES), и Vо будет зависеть от [S]. В точке С на графике (рис. 6.1) практически все молекулы фермента связаны с субстратом. Поэтому, несмотря на повышение частоты столкновений молекул E и S, дальнейшее увеличение [S] не приведет к росту скорости реакции – в реакционной смеси будут отсутствовать молекулы фермента, которые были бы свободны для связывания субстратом.
Случай В представляет особый теоретический интерес. Поскольку при этом ровно половина молекул фермента насыщена субстратом (рис. 6.2) - начальная скорость реакции будет составлять величину, равную половине максимальной скорости (1/2V max), которая может быть достигнута при данной концентрации фермента.