Клеточная стенка у разных чуваков

Муреин - пептидогликан

Свойства:

Химические:

1) по сути последовательность двух аминосахаров - N-ацетилглюкозамина (NAG) и N-ацетилмурамовой (NAM) кислоты, сшитые b-1,4-гликозидными связями; поперечные связи - пептидные мостики.

2) В поперечном направлении у грам-(+) прошит тейхоевыми кислотами (полиолфосфаты (фосфаты многоатомных спиртов) на основе глицерина с разными заместителями - через -O- связь соединены с C6-атомом в NAM.

Особенности:

а) Функция тейхоевых кислот - улучшают эластичность, действуют наподобие пружин.

б) Связывают Mg{2+} - могут выполнять роль ионообменника(??)

в) В условиях фосфорного голодания заменяются на тейхоуроновые кислоты.

Физические:

1) Эластичен (может растягивать/сжиматься до 4х раз)

2) Селективен (наибольший размер отверстия достигает 1-4 x 4-5 нм - пропускает молекулы до 55 кДа, этот размер не зависит от толщины муреинового слоя) - поэтому для сборки внеклеточных структур (жгутики, пили) или переноса ДНК при конъюгации необходимы гидролазы муреина, локально расширяющие отверстия.

Подавление синтеза муреина:

1) D-циклосерин

2) Ванкомицин

3) Пенициллин

_______________________________________________________________

Грам(+):

1) Муреин (до 40 слоёв, до 50нм, есть тейхоевые кислоты)

2) Затем ЦПМ

Грам(-):

1) Внешняя мембрана (ВМ) - состоит из 2х слоёв - внутренний из фосфолипидов (наиболее распространённый - фосфатидилэтаноламин), внешний из липополисахаридов; содержит белки (в частности белки порины), участвующие в сборке поверхностных структур, конъюгации, секреции etc..

Функция ВМ: контакт клеток между собой, с поверхностью субстрата, с клетками организма-хозяина при патогенезе.

2) Муреин (1 слой, 3 нм, нет тейхоевых кислот)

3) ЦПМ

Периплазматическое пространство - пространство между ВМ и ЦПМ.

ВМ связана с муреином с помощью липопротеина (N-концом с жирными кислотами во ВМ, C-концом связан с муреином);

Липополисахариды ВМ:

1) Основной компонент ВМ

2) Состоит из 3х частей:

1) Kdo-липид А (очень консервативен среди всех, у кого он есть)

2) Олигосахарид (более-менее консервативен, но меньше)

3) О-антиген (именно эта часть участвует во всех имунных взаимодействиях; состоит из повторяющихся полисахаридных единиц)

Археи

Клеточная стенка трёх типов:

1) Псевдомуреин (нет NAM)

2) Белковый S-слой (структурированные белки, содержащие кислые аминокислоты, за счёт чего на поверхности клетки создаётся тонкий слой воды, отталкиващий ионы солей)

3) Отсутствие клеточной стенки, тогда мембрана представлена ригидным монослоем из тетрамеров с некоторым количеством 5членных колец.

Методы термической стерилизации:

1) Прокаливание в пламени

2) Сухожаровая (горячий воздух)

3) Автоклавирование (насыщенный пар под давлением)

4) Тиндализация (=дробная стерилизация, для культур, разлагающихся от высокой температуры)

5) Кипячение

Гетероцисты:

Специализированные клетки нитчатых цианобактерий, осуществляющие азотфиксацию.

Особенности строения и функционирования

1) Неспособны к росту/делению

2) В них разрушается фотосистема II ==> нет фотосинтеза

3) Две дополнительные оболочки

а) Внутренняя - гидроксилированные гликолипиды

б) Наружная - полисахариды

4) Высокая оксидазная активность (много оксидазы)

5) По плазмдесмам от них идёт связанный азот, к ним - органика.

6) Нет цикла Кальвина, но есть окислительный пентозофосфатный путь (глюкоза/сахароза для него поставляется из соседних клеток (см.пункт 5)

Методы культивирования анаэробов

(стр.41 в практикуме)

Чтобы культивировать анаэробы, нужно свести к минимуму соприкосновение с кислородом. Используются следующие методы:

1) Выращивание в высоком слое среды (в высоких сосудах)

а) Разделяют жидкую среду на части и стерилизуют отдельно (это нужно т.к. при стерилизации высота среды должна быть не больше 1/2 высоты сосуда)

б) Перед посевом разные части среды кипятят, прогревают на водяной бане 30 мин, затем быстро охлаждают (чтобы не успел раствориться кислород), делают посев в одну из частей

в) Доливают другие части

2) Культивирование в вязких средах (картофельная среда, кукурузная мука; вязкость можно увеличить добавив 0,2% агара) - т.к. с увеличением вязкости уменьшается растворимость кислорода

3) Культивирование в толще среды

а) Делают посев в среду

(3 варианта) б.1) Оставляют в пробирках

б.2) Переливают в трубки Бурри (стеклянные трубочки 25см длиной, 1.5 см диаметром; стерилизуют, заткнув концы ватной пробкой, перед посевом заменяют резиновыми)

б.3) Переливают в чашку Петри (переливают в крышку чашки Петри, после застывания среды плотно прижимают дно; зазор между стенками заливают парафином)

4) Культивирование в анаэростатах (вакуумные камеры, из них откачивается воздух и они заполняются газовой смесью (85% N2, 15% H2CO3), и давление 0.7ати - избыточное давление исключает возможность диффундирования кислорода)

Степень восстановленности среды (степень поглощения кислорода) определяется ОкВост.потенциалом (Eh), может быть измерен потенциометром или индикатором (резазурин).

Принципы культивирования строгих анаэробов по Хангейту:

1) Все процедуры проводим, защищаясь от кислорода (анаэробный бокс, кипячение, работа в токе стерильного газа; можно поставить вещества, которые будут поглощать кислород из газа - дитионит натрия, пирогаллол, Cu при 400*С)

2) До посева в среду добавляют восстановители (цистеин, Na2SO4, тиологликат) для поглощения кислорода

3) Пересевы и добавки - с помощью шприцов с газом без кислорода

4) Все трубки/шланги для пропускания газа должны быть изготовлены из материала не допускающего диффузию сквозь него кислорода (для этого используют медь, нагретую до 400*С, в контакте с кислородом образует оксид CuO)

Как измерить амилолитическую активность?

Состав среды (г/л):

агар - 15

пептон - 10

KH2PO4 - 5

крахмал - 2

pH среды = 6.8-7

Стерилизация - при 1ати, затем в чашки Петри и посев

Продолжительность культивирования - до 10 дней

Проверка амилолитической активности: обработка р-ром Люголя (содержит крахмал - синий, не содержит - бесцветный или бурый)

Способы поддержания pH в среде:

1) Буферные растворы (обычно - фосфатный буфер), но нельзя добавлять больше 5г фосфата на 1л среды ==> если изменение pH сильное, но не поможет

2) Введение избытка мела (он будет нейтрализовать кислоты)

3) Непрерывное подведение pH автоматическими устройствами - необходимо, если нужно поддерживать pH в пределах 7.2 - 8.5 (нет буферов в этой области)