2015-05-26
2631
Цель занятия. Ознакомить студентов с действием бактериофагов и их практическим использованием.
Оборудование и материалы. Культура вакцинного штамма L. monocytogenes, набор листериозных бактериофагов, стерильный МПБ, содержащий 0,5 % глюкозы, 2%-й МПА в чашках Петри, стерильные пипетки Пастера, лечебно-профилактический бактериофаг против паратифа и колибактериоза телят, чувствительная к фагу культура Е. coli.
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
Бактериофаги представляют собой вирусы, адаптировавшиеся в процессе эволюции к паразитированию в прокариотических клетках (рис. 47). Репродукция многих бактериофагов в клетке приводит к ее лизису. На специфической адаптации фагов к строго определенным видам (штаммам) бактерий и внешнем проявлении поражения бактериальных клеток (лизис) основано практическое использование бактериофагов: при помощи известного (диагностического) фага можно обнаружить и идентифицировать бактерии. Кроме того, биологическая промышленность выпускает лечебно-профилактические бактериофаги.
|
|
|
Определение литической активности бактериофага. У диагностических и лечебно-профилактических фагов должна быть выражена литическая активность, которую определяют путем титрования фагов, например, в жидкой питательной среде.
В бактериологические пробирки разливают по 4,5 мл стерильного МПБ; в первую пробирку вносят 0,5 мл исследуемого фага, затем готовят его десятикратные разведения от 10~' до Ю-'0. К разведениям бактериофага добавляют по капле суточной бульонной культуры чувствительного к данному фагу вида бактерий, инкубируют при 37 °С 24 ч. За титр фага принимают его максимальное разведение, еще способное вызвать лизис бактерий — среда в пробирке прозрачна. Фаг считают активным при титре 10-7, 10-8
| Рис. 47. Схема строения фага Т2 по данным электронной микроскопии: а — с нуклеиновой кислотой в головке: 1 — головка; 2— полая центральная часть; 3 — оболочка (расправленная); 4— базальная пластинка; б —без нуклеиновой кислоты в головке: I — головка; 2 — оболочка (сокрашенная); 3 — хвостовые нити |
Определение количества бактериофага (по методу Грациа). Готовят десятикратные разведения исследуемого фага в физиологическом растворе (10-1…10-2 и т.д.), затем из последнего разведения, например 10-7 или 10-8, берут 0,5 мл жидкости, смешивают с равным объемом чувствительной к данному бактериофагу бульонной культуры бактерий. Полученную смесь добавляют к 4 мл расплавленного 0,7%-го МПА (температура 45 °С), перемешивают и выливают на поверхность подсушенного питательного агара в чашку Петри. Аналогичным образом поступают со всеми разведениями бактериофага (10-5, 10-5 и т.д.). Чашки инкубируют в термостате при 37 ºС 24 ч.
|
|
|
Учет результатов: не пораженные бактериофагом бактерии растут и образуют сплошной газон на поверхности питательного агара. Клетки, пораженные фагом, лизируются, и в этой зоне можно видеть «стерильные» пятна на сплошном бактериальном газоне. Количество этих пятен («бляшек») соответствует количеству фаговых частиц в суспензии (рис. 48).
Применение фагов для идентификации бактерий. Фаги применяют для видовой идентификации бактерий (возбудитель сибирской язвы, листериоза и др.) или внутривидовой — установление фаговара конкретного бактериального штамма.
Для идентификации неизвестной культуры бактерий при помощи диагностического бактериофага обычно используют плотную питательную среду. Например, исследуемую 18-часовую культуру, предположительно листерий, засевают в МПБ с глюкозой, инкубируют при 37 °С 4 ч до легкой опалесценции среды и затем засевают газоном (0,1мл) на подсушенный 2%-й МПА в чашку Петри. Через 1... 1,5 ч инкубирования посевов при 37 ºС при слегка приоткрытой крышке на одну половину газона наносят каплю листериозного бактериофага 2А и на вторую половину помещают каплю фага 4А. Посевы инкубируют при 22...25 °С 16...24ч.
Учет результатов: если культура листериозная, то на месте нанесения хотя бы одного фага можно видеть прозрачную зону лизиса.
Для установления фаговара исследуемую культуру проверяют с набором типовых фагов, охватывающих все фаговарианты данного вида бактерий, определяют, к какому фагу чувствителен данный штамм, что и служит его маркером.
ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ
1. Определить активность лечебно-профилактического коли-па-ратифозного фага по отношению к исследуемой культуре Е. coli.
2. Провести идентификацию культуры L. monocytogenes при помощи листериозных диагностических фагов.
Контрольные вопросы
1.Что такое бактериофаг?
2.Как используют бактериофаги?
3.Какими методами титруют бактериофаги?
