Фракционирование белков мышечной ткани

1.1. Получение водной вытяжки (миоген, миоальбумин, миоглобин)

Ход роботы

Мышечную ткань (0,5 г) растирают в фарфоровой ступке с 10 каплями дистиллированной воды в течение 3—5 минут до получения гомогенной массы. К растертой мышечной кашице подливают при помешивании небольшими порциями (по 5—10 капель) дистиллированную воду (всего в количестве 3 мл).

Водную вытяжку фильтруют через тройной слой марли. Остаток мышечной ткани сохраняют для получения солевой вытяжки, а с фильтратом проделывают биуретовую реакцию и высаливание альбуминов сернокислым аммонием.

1.2. Получение солевой вытяжки (миозин, актомиозин, актин, тропомиозин)

Ткань, оставшуюся после получения водной вытяжки, отмывают от следов водорастворимой альбуминовой фракции путем повторного экстрагирования новыми порциями воды до тех пор, пока промывная жидкость не перестанет давать биуретовую реакцию. Промывные жидкости выбрасывают. Отмытую ткань заливают в ступке 3 мл 5% раствора хлористого калия и растирают пестиком в течение 5 минут. В раствор переходит глобулиновая фракция белков мышечной ткани. Жидкость отделяют фильтрованием, остаток ткани сохраняют для получения коллагена, а с небольшими порциями фильтрата проделывают биуретовую реакцию, реакцию высаливания глобулинов и осаждение белка путем разведения десятикратным объемом дистиллированной воды.

1.3. Получение коллагена мышечной ткани

Для удаления следов глобулиновой фракции остаток ткани отмывают новыми порциями раствора хлористого калия до получения отрицательной биуретовой реакции. Промывную жидкость выбрасывают.

пробкой и трубкой в качестве холодильника, заливают 1 мл дистиллированной воды и кипятят на сетке около 30 минут. При нагревании коллаген соединительной ткани частично гидролизуется, превращается в желатину и переходит в раствор. Горячий раствор фильтруют и с фильтратом проделывают биуретовую реакцию. Получается сине-фиолетовое окрашивание, характерное для растворов желатины.

2. Экстрактивные вещества

Экстрактивными веществами называются органические вещества, растворимые в воде, содержащиеся в ткани в незначительном количестве. Они могут быть обнаружены только в концентрированных вытяжках — экстрактах. Экстрактивные вещества делятся на азотистые и безазотистые. К азотистым относятся: аденозинтрифосфорная, аденозиндифосфорная, адениловая кислоты, креатин, креатинфосфат, карнозин, ансерин, карнитин. аминокислоты, молочная кислота и другие соединения. К безазотистым относятся: фосфорные эфиры углеводов, лактат, пируват и др.

Креатинфосфорная кислота, или фосфаген, содержится в мышцах в количестве 0,2-0,5% и представляет собой производное креатина и фосфорной кислоты

Креатинфосфат участвует в реакции форфорилирования аденозиндифосфорной кислоты, образующейся начальной фазе мышечного сокращения, и таким образом поддерживают концентрацию аденозинтрифосфорной кислоты на определенном уровне.

Креатинфосфат накапливается в мышцах при тренировке и обусловливает большую работоспособность и незначительную утомляемость тренированных мышц. В образовании креатина принимают участие три аминокислоты: аргинин, глицин и метионин.

Открытие экстрактивных веществ

Мышечную ткань (1 г) тщательно растирают в течение 3—5 минут в ступке с 10 каплями дистиллированной воды до получения гомогенной кашицы, затем добавляют 4 мл воды и тщательно растирают еще несколько минут. Содержимое ступки переносят в широкую пробирку и нагревают на открытом огне до кипения. Выпавший осадок белка отделяют фильтрованием, а полученный фильтрат используют для обнаружения экстрактивных веществ: креатина, карнозина и молочной кислоты.

2.1. Открытие креатина

При нагревании в кислой среде креатин теряет воду и превращается в креатинин; последний может быть обнаружен специфическими для него химическими реакциями.

Ход работы

В пробирку наливают 1 мл безбелкового фильтрата мышечной ткани и 2 капли 10 % раствора серной кислоты. Пробирку закрывают пробкой со стеклянной трубкой в качестве холодильника и помещают на асбестовую сетку. Жидкость кипятят в течение 30 минут. Креатин превращается в креатинин. Жидкость охлаждают, нейтрализуют 2—3 каплями 10 % раствора соды и с небольшими порциями ее проделывают цветные реакции на креатинин: а) с раствором пикриновой кислоты, б) с раствором нитропруссида натрия.

2.2. Открытие карнозина

При нагревании раствора карнозина с диазореактивом в щелочной среде жидкость окрашивается в оранжево-красный цвет. Реакция обусловлена образованием окрашенного продукта конденсации карнозина с диазобензосульфокислотой.

Ход работы

К 5 каплям безбелкового фильтрата прибавляют равный объем диазореактива и 3—4 капли 10% раствора углекислого натрия. Жидкость принимает оранжево-красное окрашивание.

2.3. Открытие молочной кислоты

При добавлении реактива Уфельмана (FeCl₃ и фенол) к раствору, содержащему молочную кислоту, жидкость окрашивается в зеленовато-желтый цвет вследствие образования молочнокислого железа.

Ход работы

К 10 каплям 1% раствора фенола добавляют 1 каплю 1 % раствора хлорного железа. Получается реактив Уфельмана. К полученной жидкостй фиолетового цвета добавляют по каплям безбелковый фильтрат мышечной ткани. В присутствии молочной кислоты фиолетовая окраска жидкости переходит в желто-зеленую.

СПИСОК РЕКОМЕНДУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1 Эллиот Д.,Эллиот У. Биохимия и молекулярная биология. Пер.с англ.М., МАИК «Наука/Интерпериодика», 2002.- 446с (Библиотека - 9 экз.)

2 Марри Р. Биохимия человека. В 2-х томах. Издательство: Мир, 2004, 414 c. (Библиотека – по 6 экз.)

3 Шапиро Я.С. Биологическая химия:учеб. пособие/ Я.С. Шапиро. ─ СПб.:Изд-во СПбГУ: Элби-СПб,2004. ─ 367с.:ил. ─ (Горизонты профильного обучения). (Библиотека – 5 экз.)

4 Комов В.П., Шведова В.Н. Биохимия: учебник для вузов — М.: Дрофа, 2004. — 639с. — [Высшее образование: современный учебник] (Библиотека – 29 экз.).

5 Митякина Ю.А. Биохимия: учеб. пособие/ Ю.А. Митякина. ─ М.: РИОР,2005. ─ 113с. (Библиотека – 3 экз.).

6 Биологическая химия: учеб. пособие для вузов/ под ред. Н.И.Ковалевской / под ред. Н.И.Ковалевской — 2-е изд., перераб. и доп. — М.: Академия, 2008. (Библиотека – 1 экз.).