2015-05-30
538
Больному Г. 48 лет поставили предварительный диагноз: «Холера», взяты фекалии для исследования. С целью ускоренной диагностики поставили ПЦР на индикацию генов холерного токсина (ctx AB) и токсинкорегулируемых пилей (tcp A). Учесть результаты постановки ПЦР. Сделать заключение. Можно ли на основании только ускоренного метода диагностики подтвердить диагноз «Холера»?
М е т о д и ч е с к и е у к а з а н и я
Обработанный клинический образец (испражнения) 10 мкл вносят в пробирку, добавляют амплификационную смесь, состоящую из воды, буфера для проведения ПЦР, раствора дезоксирибонуклеотидфосфатов, раствора праймеров и раствора фермента Taq-полимеразы. Во вторую пробирку, маркированную «К+», вносят 2 мкл контрольного образца ДНК (содержит гены ctx AB и tcp A) и 8 мкл воды, в пробирку, помеченную «К-», вносят 10 мкл деионизированной воды. Пробирки закрывают, центрифугируют 5 с при 3000 об/мин и помещают в амплификатор. После амплификации проводят регистрацию результатов методом электрофореза в 1,2%-ном агарозном геле, приготовленном на трис-ацетатном буфере. Фрагменты анализируемой ДНК проявляются в виде светящихся красно-оранжевых полос – положительный результат; отсутствие красно-оранжевых полос – отрицательный результат. Результаты электрофореза сравнивают с положительным и отрицательным контролем.
Справочный материал для оформления протоколов
Принцип ПЦР
Первый этап амплификации системы ПЦР – это тепловая денатурация образца ДНК в результате повышения температуры в реакционной пробирке до 95°С. Кроме исходной ДНК, в реакционной пробирке содержится избыточное количество двух нуклеотидных праймеров, термостабильная ДНК-полимераза (Taq ДНК-полимераза, выделенная из бактерий Termus aquticus) и четыре дезоксирибонуклеотида. Высокая температура поддерживается в течение 1 мин.
На втором этапе температура в смеси медленно понижается до 55°С. На этом этапе праймеры спариваются с комплементарными им последовательностями в исходной ДНК.
На третьем этапе температура поднимается до 75°С, являющейся оптимальной для каталитической активности Taq ДНК-полимеразы. Синтез ДНК инициируется с 3¢-гидроксильного конца каждого праймера.
Продукты ПЦР выявляются с помощью электрофореза в агарозном геле.
Занятие №16
Микробный антагонизм. Антибиотики
Методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам
Практическое использование бактериоциногении
Вопросы для подготовки
1. Микробный антагонизм, определение понятия, его формы, биологическое значение и методы выявления. Примеры.
2. Бактериоцины, как факторы внутривидового антагонизма и персистенции. Примеры.
3. Использование бактериоциночувствительности бактерий как эпидемиологического маркера для установления идентичности культур различного происхождения.
4. Антибиотики, определение понятия, способы получения. Требования, предъявляемые к антибиотикам. Примеры.
5. Классификация антибиотиков по происхождению, химическому составу, эффекту и спектру действия.
6. Механизмы действия антибиотиков на микроорганизмы.
7. Методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам (диско-диффузионный метод, метод серийных разведений, экспресс-методы).
8. Методы определения концентрации антибиотика в биологических жидкостях (сыворотка крови, моча).
9. Устойчивость микроорганизмов к антибиотикам, механизмы формирования устойчивости и пути преодоления. Примеры.
10. Принципы рациональной антибиотикотерапии. Недостатки, осложнения и неудачи антибиотикотерапии.
