Менингококков

В чашку Петри или стеклянную пластинку размером 9 х 12 см наливают 20 мл, а на предметное стекло - 5 мл расплавленного 1% агара на физиологическом растворе. В застывшем arape с помощью металлических трубок просекают отверстия (лунки) диаметром 3 мм, из которых агаровые пробки удаляют путем отсоса этой же трубкой или острием иглы. Расстояние между центрами лунок 0,5 см.

Лунки в агаре располагают следующим образом: в центральную лунку пастеровской пипеткой наливают сыворотку, в периферические - прогретые при температуре 100°С в течение 15 минут взвеси испытуемых культур. Микробную кипяченую взвесь можно хранить в холодильнике в течение 2-х недель. Для реакции микропреципитации используют не разведенные сыворотки.

Концентрация испытуемой суточной культуры менингококка, выращенной на 20% сывороточном агаре, должна составлять 30-60 единиц, т.е. быть в 3-6 раз гуще оптического стандарта мутности в 10 единиц. Чашки Петри или стеклянные пластины с лунками, заполненными сывороткой и антигенами, помещают во влажную камеру (эксикатор с водой) на 24-48 часов при температуре 20-22°С. По окончании срока учитывают реакцию. Реакция проявляется только со штаммами менингококков гомологичной серогруппы в виде линии преципитации.

11.5 Метод ВИЭФ

У больного гнойным менингитом, желательно до применения химиотерапии, берут СМЖ, которую исследуют на присутствие специфического полисахаридного антигена. Для этого используют аппарат для иммуноэлектрофореза ПЭФ-3 или другой любой марки. В аппарат заливают "камерный" вероналмединаловый буфер, содержащий в 1 л дистиллированной воды 21,9 г мединала и 3,45 веронала (веронал надо греть на водяной бане до полного его растворения) рН = 8,6. Приготовленный 1% агар (п.11.3.1), растопленный и остуженный до 60°С, наносят в количестве 20 мл на поверхность стеклянной пластинки, размером 9 х 12 см, помещенную на горизонтальный столик. После застывания агара пробойником или металлической трубкой, диаметр которой равен 3 мм, высекают 2 параллельных ряда отверстии на расстоянии 3 мм друг от друга, по числу групповых сывороток. Ряды располагают перпендикулярно к направлению силы тока.

Антисыворотки вносят в лунки, расположенные со стороны анода (+), а спинномозговую жидкость в лунки со стороны катода (-). Сыворотку вносят в отдельную лунку. В отдельную лунку помещают заведомо положительный контроль, который позволяет оценить правильность постановки теста. В качестве контроля используют менингококковую вакцину серогруппы А или C с гомологичноq сывороткой, в концентрации 10-20 мкг/мл. Приготовленную пластинку помещают в аппарат для иммуноэлектрофореза на 20-30 мин. при силе тока 12-15 МА на 1 стекле. Аппарат работает при комнатной температуре. При положительной реакции через 10 мин. после выключения тока, между лунками (с одной из сывороток и ликвором) появляются линии преципитации, которые хорошо видны в проходящем свете. В случае, когда антигена мало, линии преципитации проявляются на следующие сутки (пластинка находится во влажной камере). Для ускорения этого процесса в тот же день, можно 2-3 раза пропускать ток через пластину в течение 5-10 минут, т.е. время анализа увеличивается до 60 мин. Формулировку ответа на ВИЭФ см.п.9.1.

12. Приготовление и стерилизация тампонов для взятия
носоглоточной слизи

Для взятия носоглоточной слизи используют ватные тампоны, укрепленные на металлической проволоке. Лучше всего применять проволоку из малоокисляемого металла (алюминия) диаметром 2-3 мм. Проволоку изгибают под углом 135° на расстоянии 1-2 см от конца, на которой накручивают ватный тампон; 5-10 таких проволок завертывают в бумагу и стерилизуют сухим жаром или в автоклаве. Можно использовать также стерильные ватные тампоны на проволоках, вмонтированных в пробирку.

13. Создание повышенной концентрации углекислоты
при культивировании посевов на чашках Петри и в пробирках

(рекомендуется при первичном выделении менингококков из ликвора, крови и получении биомассы).

Для создания повышенной концентрации С02 можно использовать любой сосуд с притертой крышкой, например, эксикатор. Засеянные чашки помещают внутрь сосуда вверх дном, там же укрепляют зажженную свечу высотой 2-3 см и закрывают крышкой, которой может служить и простое большое стекло. К моменту затухания свечи в сосуде создается повышенная концентрация С02 (7-10%). После этого сосуд с посевами помещают в термостат.

Руководитель Департамента

Приложение 4