2015-06-10
647
Двигательная активность обонятельных жгутиков обеспечивается не только наличием в их структуре микротубулярного цитоскелета, но и АТФ (Бронштейн, 1966; 1977). А.А. Бронштейн обратил внимание на необходимость энергетического обеспечения цилиарной подвижности, установив, что при добавлении АТФ в среду с обонятельной выстилкой движения жгутиков, остановленные митохондриальными ингибиторами, восстанавливались. С этим выводом можно согласиться только отчасти. Действительно, из результатов их опытов следует, что спонтанная активность связана с потреблением энергии макроэргов, синтезируемых митохондриями. И она исчезает, если этот синтез подавлен.
Исходя из современных представлений о механизме действия этого макроэрга, можно предположить, что в опытах А.А.Бронштейна не внеклеточный АТФ непосредственно послужил источником энергии для обонятельных клеток. Вероятно, его действие опосредуется пуринорецепторами, обнаруженными в плазмолемме обонятельных и вкусовых клеток. Показано (Барышников и др., 2002), что во вкусовых клетках он мобилизует ионы кальция. Может быть, с участием этого иона могло сниматься ингибиторное влияние на митохондрии, в результате чего восстанавливались пассивные движения жгутиков. К сожалению, не было проведено исследований инициирующего воздействия одорантов на остановленные жгутики.
До сих пор нет ответа на вопрос об участии метаболических процессов в механизме сигнальной трансдукции в обонятельных клетках. О них судили главным образом посредством гистохимического анализа содержания АТФ и различных ферментов в обонятельной слизи. Показали, что при 15-минутном воздействии камфорой концентрация АТФ в обонятельном эпителии снижалась на 33%, что может быть обусловлено необходимостью фосфорилирования в первичном механизме хеморецепторного процесса (Гладышева и др., 1984).
Под действием пахучих стимулов происходит активация щелочной фосфатазы обонятельной выстилки, что способствует созданию высокого уровня неорганического фосфата, необходимого для синтеза АТФ, происходящего в митохондриях рецепторных клеток (Гладышева и др., 1980 а, б; Кукушкина, Гладышева, 1982).
Исходя из гистохимических данных, был сделан вывод об активации дыхательных ферментов в обонятельных клетках. Об этом говорит наличие в булаве рецепторных клеток белковых сульфгидрильных групп, липидов, выраженная активность окислительных ферментов и фосфомоноэстераз, причем содержание и активность ферментов в обонятельных клетках выше, чем в опорных. В рецепторных клетках интенсивно протекают процессы белкового и нуклеинового обменов, окислительного фосфорилирования и ферментативного гидролиза (Бронштейн, 1966).
Булава весьма богата митохондриями. Особенностью распределения этих органоидов в клетках является их транспорт в область с высоким потреблением энергии, который совершается вдоль микротрубочек, локализующихся в обонятельных клетках главным образом в периферических отростках, и вдоль актиновых филаментов. Известно, что пространственное распределение митохондрий очень важно для функционирования, и его нарушение приводит к гибели клеток. При этом митохондриальная подвижность тесно связана с их метаболической активностью: малоактивные митохондрии более подвижны, чем высокоактивные (Wagner, 2003). Поскольку подвижность митохондрий и метаболическая функция скоординированы, вероятно, именно митохондрии с высокой метаболической активностью скапливаются в области булавы, обеспечивая энергией процессы обонятельной рецепции.
В клетках многих типов катаболические процессы активируются прежде всего посредством цАМФ (Дорофеев и др., 1978; Самойлов и др., 1978). Содержание циклонуклеотида в цитозоле определяется активностью ферментов, катализирующих его синтез. В состоянии покоя в клетке происходит постоянный синтез и гидролиз цАМФ. Но уровень его поддерживается одинаковым. При активации аденилатциклазы лигандом скорость синтеза цАМФ начинает превышать скорость его деградации. В результате повышается концентрация циклонуклеотда в клетке. Уровню цАМФ достаточно повысится на 20 – 30%, чтобы началась активация протеинкиназ, причем небольшие изменения концентрации этого вещества приводят к существенной динамике активности ферментов. Они, свою очередь, опосредованно, через изменение структуры субстрата, могут влиять на активность фосфатаз (Крутецкая и др., 2003). Таким образом, повышение концентрации цАМФ сопровождается «метаболической бурей» в клетках, цАМФ играет основную роль в качестве регулятора метаболизма (Лукьянова и др., 1982).
Перестройка клеточного метаболизма связана с активностью и другой сигнальной системы. Под воздействием различных факторов роста (например, эпидермальные факторы роста, факторы роста тромбоцитов или нейротрофины) в клетках активируется семейство рецепторных тирозинкиназ. Через эти рецепторы регулируется клеточная выживаемость, пролиферация, рост аксонов и дендритов, экспрессия и активность таких функционально важных протеинов, как ионные каналы, а также сборка и ремоделирование цитоскеклета.
Цитоплазматические домены TRK-рецепторов содержат несколько мест тирозинового фосфорилирования, которые участвуют в каскадах внутриклеточной сигнализации. В результате активируются маленькие G-протеины, включая Ras, Rap-1, и семейство Cdc-42.Rac-Rho, а также путь, регулируемый MAP-киназой, PI-3-киназой и PLC-гамма (Huang, Reichardt, 2003). Фосфолипаза С-гамма1 при этом активируется, затем гидролизует мембранные фосфоинозитиды и синтезирует диацилглицерол и IP3, который высвобождает Са2+ из внутриклеточных депо, посредством чего активируются такие энзимы, как Са2+-регулируемые изоформы протеинкиназ и Са2+-кальмодулин-зависимых протеинкиназ. Диацилглицерол стимулирует регулируемые им изоформы протеинкиназы С, которые фосфорилируют различные клеточные белки, активируя их (Крутецкая, Лебедев, 1998; Крутецкая и др., 2003).
Таким образом, стимуляция рецепторных тирозинкиназ приводит к активации разветвленной цепи событий в клетке, направленных на выполнение различных функций, а, следовательно, перестраивет клеточный метаболизм.
Известно, что уровень функциональной активности клеток тесно коррелирует с интенсивностью их дыхания. На миоцитах, нейронах, гепатоцитах, макрофагах и других клетках показано, что любые внешние воздействия, как физические, так и химические, влияют прямо или опосредованно на различные звенья окислительного метаболизма (Лукьянова и др., 1982). На примерах нейрона рецептора растяжения речного рака и поперечно-полосатой мышцы лягушки было показано, что умеренные физические нагрузки активизируют митохондрии этих клеток, изменяя окислительно-восстановительное состояние переносчиков электронов по дыхательной цепи (Карнаухов, 1971).
Скорость метаболических процессов зависит от функционирования митохондрий, а это, в свою очередь, связано с активной регуляцией структуры органоидов. В настоящее время отходят от представления о митохондриях как собрании отдельных продолговатых образований с пластиноподобными кристами. Ультраструктурный анализ митохондрий разных типов клеток выявляет их в виде динамической сети – «митохондриального ретикулума».
Электронно-томографический анализ выявляет кристы в виде собрания структур в форме трубочек или ламелл. Каждый миллилитр суспензии митохондрий, выделенных из мышц позвоночных, имеет максимальную скорость дыхания 3 – 5 мл О2 в мин и обладает поверхностью крист около 20 – 40 м2 (Moyes et al., 2003). С точки зрения авторов, организация митохондрий в ретикулум приносит большую пользу аэробным тканям. Если предположить, что эта сеть действует как электрический кабель, то электрогенные события, возникшие в одном месте, способны быстро проводиться по ретикулуму. Вместе с тем такая сеть обеспечивает быструю диффузию кислорода.
Однако наряду с митохондриями, организованными в ретикулум, в клетках встречаются и отдельные субмембранные органоиды. Преимущество двух различных, специализированных их популяций может быть связано с расположением относительно метаболической продукции внутри клетки и градиентами О2 и метаболитами в крови. С этим связано скопление этих органелл в областях с высокой степенью метаболических процессов. Так, в миоцитах они концентрируются возле их сократительного аппарата, а в обонятельных клетках – в булаве периферического отростка (Бронштейн, 1966; 1977).
Показано, что изменение биоэнергетики способствует пролиферации митохондрий, причем на экспрессию респираторных генов влияет активация протеинкиназы А, а также повышение содержания Са2+ в цитозоле, в результате которого активируются такие Са2+-чувствительные протеинкиназы, как Са2+-кальмодулин-зависимая протеинкиназа и протеинкиназа С (Moyes et al., 2003).
Показано, что агонисты, вызывающие повышение содержания Са2+ в цитозоле, увеличивают уровни митохондриального, а, следовательно, цитозольного АТФ (Jouaville et al., 1999; Rizzuto et al., 2000). Это обусловливается повышением активности митохондриальной AТФ-синтазы (Duchen, 2000).
Однако прижизненное изучение митохондриального дыхания хеморецепторных клеток in situ посредством флуоресцентного анализа восстановленных пиридиннуклеотидов (НАДН) и окисленных флавопротеидов (ФП) проводилось только во вкусовых почках и каротидном теле. Показано, что во вкусовых и каротидных хеморецепторах с динамикой клеточного дыхания непосредственно связаны механизмы трансдукции некоторых химических стимулов (Самойлов и др., 1978; Соловьев, Самойлов, 1978).
Показано, что метаболические системы вкусовых клеток непосредственно участвуют в кодировании информации только о горечах и кислотах. В рецепции сладких и соленых веществ они осуществляют только энергетическое обеспечение кодирования. Гипоксия, действие кислотного стимула и кофеина на гломусную ткань вызывали изменения активности клеточного дыхания (Соловьев, Самойлов, 1977 а, б; Самойлов и др., 1978; Самойлов и др., 1980; Самойлов, 1983).
Вместе с тем известно, что действие адекватных стимулов на невозбудимые ткани активирует внутриклеточные сигнальные системы, перестраивающие весь клеточный метаболизм. Показано, что внутриклеточные посредники, как правило, повышают активность митохондриальных ферментов, усиливают окислительное фосфорилирование и таким образом активируют клеточное дыхание (Rizzuto et al., 1993; Jouaville et al., 1999; Duchen, 2000; Nicholis, Budd, 2000; Checchini, 2003).
В обонятельных клетках под действием одорантов тоже повышается уровень внутриклеточных мессенджеров, приводя к перестройке клеточного метаболизма (Saito et al., 1998; Matsuzaki et al., 1999; Iorgenko, Levin, 2000). Однако прижизненного изучения реакций на пахучие стимулы метаболических систем рецепторных клеток обонятельной выстилки не проводилось.
Из обзора литературы следует, что в понимании молекулярных механизмов обонятельной рецепии достигнуты определенные успехи. Иденитифицированы рецепторные молекулярные комплексы, выявлены ключевые ферменты путей сигнальной трансдукции – аденилатциклазный и фосфоинозитидный. Показано, что синтезируемые ими вторичные посредники открывают ионные каналы для входа кальция из внеклеточной среды, что обеспечивает сопряжение между конформационными изменениями рецепторных молекул и электрическими процессами в обонятельных клетках. Доказано, что компоненты передачи сигнала в рецепторных клетках сосредоточены в их обонятельных жгутиках, которые при отсутствии раздражителя совершают постоянные неупорядоченные волнообразные, колебательные или воронкообразные движения.
Однако на многие вопросы, касающиеся изучения механизмов обонятельной трансдукции, ответы не получены. Установлено участие аденилатциклазы в рецепции одорантов, а фосфоинозитидный путь связывают с восприятием феромонов. Однако показано, что он осуществляет трансдукцию сигналов и в обонятельных клетках, но до сих пор не выяснено, в каких взаимоотношениях находятся эти пути в обеспечении обонятельной рецепции.
Не исследуется возможное участие других сигнальных систем в трансдукции одорантов, в частности, тирозинкиназной. Нет данных о том, отличаются ли компоненты трансдукции сигналов об одорантах, имеющих качественно разные запахи. Не прослежена последовательность включения в обонятельную трансдукцию компонентов сигнальной системы, активируемой данным пахучим веществом.
Если во вкусовой, каротидной и медуллярной рецепции доказано наличие гетерогенных механизмов восприятия качественно разных агентов, то при исследовании обоняния не задумывались о возможной роли гетерогенности первичных рецепторных процессов при обонянии веществ, обладающих различными запахами.
Нет сведений об энергетическом метаболизме обонятельных клеток, включая обеспечение энергией двигательной активности обонятельных жгутиков. Не установлены различия в изменениях движений жгутиков под действием качественно разных одорантов, а также возможная роль реорганизации цитоскелета, инициируемой действием пахучих веществ.
Поэтому целью диссертации являлось изучение различий в механизмах обонятельной трансдукции сигналов об одорантах, обладающих разными запахами.
