Методы люминесцентной микроскопии

Для решения поставленных перед нами задач применялись следующие методы:

– анализ вторичной флуоресценции комплекса: Са²⁺-ХТЦ-КМ;

– метод изучения собственной флуоресценции восстановленного пиридиннуклеотида и окисленных флавопротеидов (по П.Чансу в модификации В.Н.Карнаухова и В.О.Самойлова);

– конфокальная сканирующая иммунофлуоресцентная микроскопия.

2.2.1.Флуоресцентный анализ мембраносвязанного кальция в обонятельных клетках

Ионы кальция обладают интегрирующей функцией, его называют мультифункциональным мессенджером, влияющим на глобальные внутриклеточные процессы (Williams, 1988). Им принадлежит важная роль в обонятельной трансдукции (Winegar et al., 1988; Menini, 1999). Помимо генерации рецепторного потенциала в невозбудимых клетках с участием Са²⁺ включается активность киназ, фосфатаз, ионных насосов, активация митохондрий и внутриклеточных сигнальных систем (Sham, 1997). Ионы кальция контролируют фундаментальные клеточные функции (Drummond et al., 2000; Hajnoczky et al., 2000). Поэтому кальций может служить индикатором вовлечения того или иного сигнального пути в ответ на одоранты. Са²⁺ в качестве индикатора имеет преимущество, поскольку зонды для него и системы измерения гораздо более чувствительны, чем для любого другого клеточного параметра (Rizzuto et. al., 2000).

Зондом на мембраносвязанный кальций является хлортетрациклин (ХТЦ), с помощью которого можно изучать клеточные процессы в суспензиях изолированных органелл, на целых тканях и в клетках в составе тканей.

Изменения в мембранах, вызванные воздействием физических или химических факторов, которыми являются и одоранты, отражаются на интенсивности свечения этого зонда (Владимиров и др., 1978; Владимиров, Добрецов, 1980; Лисовский и др., 1984; Самойлов, 1985). Показано (Carvalho, Carvalho, 1977), что флуоресценция ХТЦ обусловлена связыванием кальция мембранами. Величина свободного кальция в цитозоле строго контролируется с помощью цитоплазаматических кальциевых буферов, механизмов, выводящих Са²⁺ из клетки и кальций-секвестрирующих систем. Посредством забуферивания связывается значительное количество этого иона (до нескольких мМ), оставляя менее 1 мкМ свободной фракции. Большое количество кальция связывается отрицательно заряженными головками фосфолипидов, а также низко- и высокоафинными связывающими протеинами, которые снижают концентрацию свободного кальция в субмикромолярной области (Cavagioni, 1989).

В основе использования хлортетрациклина лежит его способность резко увеличивать квантовый выход флуоресценции, попадая в гидрофобное окружение биологической мембраны. В присутствии кальция увеличивается сродство ХТЦ к мембране и квантовый выход его комплекса с ней. В результате обе эти причины вызывают усиление свечения. В присутствии Са²⁺ зонд практически полностью связан с мембраной. Известно, что хлортетрациклин проникает через плазмолемму. Оптимальную флуоресценцию комплекса: Са²⁺-ХТЦ-КМ регистрировали при 25 мкМ концентрации хлортетрациклина (Carvalho, 1978).

Показано, что рост интенсивности флуоресценции идет параллельно с накоплением меченого кальция, входящего в клетку из внеклеточной среды (Dixon et al., 1984). Следовательно, интенсивность флуоресценции отражает процесс переноса ионов кальция через плазмолемму. При этом повышение концентрации цитозольного кальция приводит к увеличению содержания комплекса: Са²⁺-ХТЦ-КМ с цитозольной стороны мембраны и увеличению количества связанной с ней флуоресцирующей формы (Поглазов и др., 1975). Следовательно, люминесцентное исследование живых тканей при помощи хлортетрациклина отображает динамику транспорта этого иона.

Однако по изменению кальций-аккумулирующей способности мембран можно оценивать не только транспорт Са²⁺ через плазмолемму, но и вовлечение каскада ферментативных реакций, связанных с активацией внутриклеточных сигнальных систем, поскольку их активность регулируется ионами кальция. Поэтому применение ХТЦ в качестве флуоресцентного зонда удовлетворяет решению той задачи, которая перед нами поставлена, а именно, определить по динамике мембрано-связанного кальция участие той или иной сигнальной системы в рецепции одорантов.

Для исследования кальций-аккумулирующей способности мембран рецепторных клеток обонятельную выстилку помещали в 25 мкМ раствор ХТЦ, приготовленный на растворе Рингера (рН 7,33), и инкубировали в течение 40 – 45 минут. Затем ее размещали на предметном стекле под объективом люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ – МП (рис.1). В нем источник света коллектором и линзой проецируется в плоскость апертурной диафрагмы, затем системой линз и светоделительной пластинки переносится в плоскость выходного зрачка объектива. Полевая диафрагма объективом проецируется в плоскость объекта. Из общего излучения источника с помощью светофильтра выделяется свет, возбуждающий люминесценцию. Для предохранения препаратов и светофильтров от нагрева ртутной лампой предусмотрена кювета, наполненная дистиллированной водой и служащая теплозащитным фильтром. Светоделительная пластинка («зеленая») отражает 360 – 440 нм и пропускает 480 – 700 нм, что необходимо для исследования флуоресценции комплекса: Са²⁺-ХТЦ-КМ.

Флуоресценцию комплекса: Са²⁺-ХТЦ-КМ возбуждали ртутной лампой сверхвысокого давления ДРШ-250 М, имеющей высокую яркость и хорошую стабильность свечения (колебание светового потока излучения не превышает около 1%) и работающей на постоянном токе.

Для выделения возбуждающей флуоресценцию длины волны с максимумом на 390 нм применяли светофильтры СС и СЗС. Интенсивность флуоресценции регистрировали на длине волны 520 нм. Через препарат обеспечивали проток ХТЦ, покрывающий обонятельный бугорок тонким слоем, чтобы не препятствовать диффузии одорантов к рецепторным клеткам.

Световой сигнал от обонятельной выстилки поступал на фотоэлектронный умножитель, затем, через аналого-цифровой преобразователь, – в компьютер.

2.2.2. Флуоресцентный анализ клеточного дыхания обонятельных клеток

Митохондриальное дыхание в обонятельных клетках исследовали методом прижизненной люминесцентной микроскопии изолированной обонятельной выстилки лягушки. Методы люминесцентного анализа позволяют изучать физико-химические процессы, протекающие непосредственно в живой клетке и ее органоидах. В отличие от методов, используемых в классической биохимии, здесь в качестве объекта исследования выступают макромолекулярные системы, выполняющие определенные функции в неразрушенной живой клетке, а также в клетках in situ. Причем изменения интенсивности собственной люминесценции отражают динамику концентрации определяемых веществ в ходе тех или иных изменений функционального состояния препарата. Среди физико-химических процессов в клетке существенную роль могут играть изменения тканевого дыхания (Карнаухов, 1972; 1976; 1978), которые могут быть связаны с актом рецепции, в том числе и обонятельной.

По сравнению с изолированными митохондриями функции в клетке организованы гораздо сложнее, в условиях in situ сохраняются процессы переключения путей метаболической регуляции, за которыми можно проследить по динамике изменений люминесценции переносчиков электронов по электрон-транспортной цепи митохондрий. Посредством анализа собственной флуоресценции можно решать проблемы, связанные с внутриклеточной регуляцией обмена веществ и энергии (Карнаухов, 1976). В свою очередь, реакции дыхательной цепи – терминального этапа биологического окисления, являются интегральным показателем динамики обмена веществ. Он раньше других отзывается на изменения метаболической активности клетки (Chance, Conndly, 1957; Giacobini et al., 1963; Зинченко, 1972; Карнаухов, 1971; 1977). Этот метод позволяет изучать биохимические реакции клеток на адекватные раздражители. Среди этих реакций существенную роль могут играть изменения активности дыхательной цепи митохондрий, связанные с актом рецепции (Соловьев, Самойлов, 1977 а, б; Самойлов, 1983).

Биологической основой применения метода люминесцентного анализа к изучению взаимодействия энергетических систем клетки с ее функциональными механизмами является то, что многие ферменты и коферменты, входящие в системы окислительного метаболизма, обладают характерными спектрами поглощения и люминесценции в окисленном и восстановленном состоянии (Карнаухов, 1976).

Флуоресценция живых клеток и тканей в диапазоне длин волн от 400 до 600 нм определяется главным образом свечением восстановленных пиридиннуклеотидов (НАДН) и окисленных флавопротеидов (ФП) (Chance et al., 1965; Карнаухов, 1977). Они являются коферментами дегидрогеназ, поставляющих электроны и протоны в дыхательную цепь митохондрий, согласуя ее с циклом Кребса и другими ферментативными системами (Ленинджер, 1985; Cecchini, 2003).

В литературе накоплены многочисленные данные, свидетельствующие о тесной корреляции реализации специфической клеточной функции с клеточным дыханием и окислительно-восстановительным состоянием электронных переносчиков (Chance, Connely, 1957; Пильщик и др., 1964; Chance et al., 1965; Chance, Schoener, 1966; Bull, Lutkenhoff, 1973). Соотношение окисленных и восстановленных форм компонентов окислительного метаболизма определяется функциональной активностью клетки. Переход из состояния покоя в состояние активного обмена сопровождается изменением окислительно-восстановительного состояния дыхательной цепи митохондрий, что свидетельствует о разном метаболическом состоянии энергосистем клетки (Карнаухов, 1976).

Максимум интенсивности собственной флуоресценции НАДН находится в синей области спектра, приходящейся на область от 455 до 480 нм. При окислении пиридиннуклеотиды теряют способность люминесцировать. Известно, что в клетке существуют различные пулы НАДН, вносящие свой вклад в люминесцентный сигнал. Суммарная интенсивность свечения в этой области определяется вкладами НАДН и НАДФН, соотношение которых не эквимолярно (Scholz et al., 1969; Estabrook, 1962). В нервной ткани и мышцах животных стационарная концентрация НАДН в 4 раза выше, чем НАДФН (Glock, Lean, 1955; Lowry et al., 1957; Giacobini, Grasso, 1966). Показано, что квантовый выход собственной флуоресценции НАДФН в 4 раза ниже, чем НАДН (Jobsis, Duffield, 1967). В опытах на изолированных митохондриях печени (Avi-Dor et al., 1962) и перфузируемой печени установили, что изменения интенсивности синего свечения отражает окислительно-восстановительное состояние НАДН и практически не зависит от НАДФН. Поэтому вкладом НАДФН в флуоресцентный сигнал в области 455 – 480 нм можно пренебречь.

Не менее важно оценить вклад гликолитического и митохондриального НАДН в суммарную флуоресценцию. Согласно имеющимся экспериментальным данным, вклад второго пула в общий сигнал почти в 10 раз выше, чем цитоплазматического (Avi-Dor et al., 1962; Jobsis, Duffield, 1967), и это соотношение увеличивается в 50 раз в нервной ткани (Doane, 1967). Можно полагать, что и в обонятельных клетках, являющихся модифицированными нейронами, синюю флуоресценцию обеспечивают главным образом митохондриальный никотинамидадениндинуклеотид (пиридиннуклеотид).

Среди флавопротеидов основное внимание уделяется прежде всего производным рибофлавина: флавинмононуклеотиду (ФМН) и флавинадениндинуклеотиду (ФАД). Оба флавиновых нуклеотида отличаются от приридиннуклеотидов тем, что прочно связаны с белком и называются флавопротеидами. Они переносят электроны от субстрата к рибофлавиновому компоненту кофермента. Наиболее интересным из них являются сукцинат- и НАДН-дегидрогеназы. Второй фермент катализирует восстановление своего флавинового кофермента восстановленным пиридиннуклеотидом.

Окисленным флавопротеидам (ФП) свойственна собственная флуоресценция на длине волны 520 – 530 нм, которая обусловлена рибофлавином. При восстановлении флавопротеиды теряют способность люминесцировать (Thorell, Chance, 1959). Редокс-переходы ФП относятся только к одному пулу, так как их флуоресценция на 90% обеспечивается митохондриальными фракциями (Chance, Schoener, 1966; Scholz et al., 1969; Лукьянова и др., 1982). Преобладание в суммарной флуоресценции митохондриальных пулов НАДН и ФП обеспечивает при исследовании собственной флуоресценции живой ткани получение данных о функционировании дыхательной цепи – системы терминального окисления, встроенной во внутреннюю мембрану митохондрий.

Для исследования собственной флуоресценции НАДН и ФП в обонятельных клетках препарат изолированной выстилки инкубировали в растворе Рингера (рН 7,33) в течение 40 – 45 минут. Достаточно длительный срок инкубации связан с тем, что в свежеприготовленных препаратах изменены их функциональные свойства. В частности, в них снижена концентрация АТФ, нарушено ионное равновесие. Для ранних сроков после приготовления характерно ослабление степени энергизации. Стабилизация наступает через 40 – 60 минут (Лукьянова и др., 1982).

После инкубации выстилку размещали под объективом люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ – Р8 (рис. 2). Преимущество метода возбуждения люминесценции, при котором один и тот же высокоапертурный микрообъектив используется и для концентрирования возбуждающего излучения на объекте и для отведения люминесцентного излучения этого объекта заключается в максимально высокой яркости светового сигнала, отводимого от люминесцирующего объекта, которая пропорциональна четвертой степени апертуры микрообъектива. Например, при увеличении апертуры объектива х10 от 0,2 до 0,4 яркость флуоресценции, отводимой от препарата, увеличивается в 16 раз при прочих равных условиях (Карнаухов, 1978). Это позволяет подобрать такой режим возбуждающего света, при котором его влияние на функциональное состояние объекта минимально.

Достоинством микроскопа ЛЮМАМ-Р8 является то, что он позволяет одномоментно измерять собственную флуоресценцию НАДН и ФП в реальном времени. Излучение этих компонентов дыхательной цепи, проходя через монохроматор и свой фотоэлектронный умножитель, усиливается и преобразовывается в электрические сигналы, которые регистрируются на компьютере.

2.2.3. Конфокальная сканирующая иммунофлуоресцентная
микроскопия

Полимеризованный F-актин определяли посредством конфокальной сканирующей иммунофлуоресцентной микроскопии. Для этого обонятельную выстилку резали на тонкие пласты и помещали на силиконизированные покровные стекла, покрытые фибронектином, и культивировали в течение 1 ч. Затем препарат фиксировали 3% раствором формалина на растворе Рингера 10 мин, пермеабилизовывали 0,1% раствором тритона Х-100 на растворе Рингера 15 минут. Обонятельную выстилку промывали 3 раза раствором Рингера и инкубировали с моноклональными антителами к р65 и вторыми антителами, конъюгированными с TRITC, полученными против иммуноглобулинов мыши. Все инкубации с антителами проводили 30 минут и клетки трижды промывали раствором Рингера после каждой инкубации.

Разрушали полимеризованный F-актин с помощью цитохалазина. Для этого через час после культивирования обонятельной выстилки на силиконизированных покровных стеклах меняли среду на другую, содержащую 100 нг×мл^-1 эпидермального фактора роста и 2 мкг×мл^-2 цитохалазина и повторяли описанную выше процедуру.

Препараты исследовали с помощью конфокального микроскопа Leica (ФРГ). Для возбуждения флуоресценции использовали HeNe лазер с длиной волны 543 нм. Применяли сканирование в области флуоресценции на длине волны 580 – 640 нм.

2.3. МЕТОД ПРИЖИЗНЕННОЙ ТЕЛЕВИЗИОННОЙ МИКРОСКОПИИ

Метод прижизненной телевизионной микроскопии позволяет в реальном времени изучать подвижность обонятельных жгутиков (рис. 3). Для этого тонкий срез препарата обонятельной выстилки в капле раствора Рингера (рН 7,33) размещали на предметном столике светового микроскопа МИКМЕД-2 ОАО "«ЛОМО». В качестве источника освещения использовали галогеновую лампу (6В, 25 Вт). В исследованиях использовали объектив 63х/0,8 (воздушная иммерсия), фотонасадку 14х и нейтральный светофильтр.

Изображение объекта регистрировали видеокамерой КРС-300С фирмы КТ и С, которая имеет разрешение по горизонтали 380 телевизионных линий. Минимальная освещенность на препарате составляет 0,1 люкс. Кроме того, в данной видеокамере предусмотрены автоматический баланс белого, позволяющий получать четкое изображение микрообъекта, и функция компенсации засветки, которая повышает верность воспроизведения изображения, особенно в случае, если источник света расположен напротив видеокамеры, что имеет место в данной установке.

Светочувствительным элементом в используемой нами камере служила ПЗС-матрица, состоящая из большого числа светочувствительных ячеек, в которых под воздействием света накапливается отрицательный заряд определенной величины. Этот заряд преобразуется в напряжение, величина которого, в свою очередь, переводится в цифровую форму в аналого-цифровом преобразователе камеры.

Разрешающая способность ПЗС-матрицы определяется количеством составляющих матрицу элементов (пикселей) и ее размером. Используемая видеокамера передает данные в телевизионном стандартном PAL. Поэтому число пикселей, необходимых для фиксации изображения, составляет 415000. Размер ПЗС-матрицы – 20,2 мм². Следовательно, разрешающая способность данной видеокамеры составляет 7 мкм. Поскольку экран монитора увеличивает изображение в 4 раза, то общее увеличение системы для прижизненной люминесцентной микроскопии составляло 3528 крат. Это позволяло увидеть отдельные обонятельные жгутики на тонких срезах обонятельной выстилки и наблюдать их движение.

Регистрацию цилиарной двигательной активности у обонятельных клеток проводили с помощью описанной цифровой видеокамеры через плату ввода видеоизображения на жесткий диск персонального компьютера с процессором Intel Pentium I. В данной установке использовали плату ввода видеоизображения Studio DC 10 plus фирмы Pinnacle Systems Inc. Эта плата не зависит от телевизионных стандартов и позволяет оцифровать сигнал в стандарте PAL, который был выбран в ходе предварительных исследований, при разрешении 720х540 пикселей и частоте 25 кадров в 1 с. Записанные на жесткий диск компьютера видеоизображения обрабатывали специальной программой Pinaccle Studio 7.0, поставляемой вместе с платой ввода Studio DC 10 plus, и программой Virtual Dub 1.3 c.

Стимуляция препарата в данной методике отличалась от предыдущих. Растворы одорантов подавали в проток под покровное стекло и регистрировали двигательную активность обонятельных жгутиков в ответ на раздражитель.

2.4. ЭЛЕКТРООЛЬФАКТОГРАФИЯ

Флуориметрические показатели обонятельной рецепции, применяемые впервые в нашей работе, мы сопоставляли с электрофизиологическими параметрами реакций обонятельных рецепторов на одоранты. Для этого мы регистрировали электроольфактограмму (ЭОГ). ЭОГ представляет собой сложный сигнал от обонятельных клеток in situ, происходящий в результате медленных колебаний потенциала между поверхностью обонятельной выстилки и подлежащей тканью, которые регистрируются электродом, помещенном на поверхности обонятельного эпителия. Негативная волна ЭОГ – это рецепторный потенциал, который отражает суммарный ответ деполяризованных обонятельных клеток (Минор, Бызов, 1977; Минор, Васильева, 1980). С помощью ЭОГ

регистрируется электрическая активность и нерецепторных элементов, но их вклад незначителен, и им можно пренебречь (Минор, 1980; Frings et al., 1991; Scott, Brierly, 1999; Scott et al., 2000; Scott-Jhonson et al., 2000; Takeuchi, Kurahashi, 2003). Следовательно, ЭОГ адекватно отображает процессы обонятельной рецепции.

Схема установки для регистрации электоольфактограммы представлена на рис. 4. Для отведения ЭОГ изолированную обонятельную выстилку помещали на покровное стекло в каплю раствора Рингера, покрывающего ее тонким слоем. Сигнал отводили стеклянными электродами, один из которых размещали на поверхности препарата, а другой – под ним. Электроды заполняли 3М раствором хлористого калия. После усиления и преобразования сигнал регистрировали на персональном компьютере и обрабатывали посредством компьютерных программ.