Теоретическое введение

Наличие электрического заряда на поверхностной мембране живых клеток называют мембранным потенциалом или потенциалом покоя. В состоянии покоя наружная поверхность клеточной мембраны заряжена положительно, а внутренняя - отрицательно. Уже более века ведутся работы по изучению потенциала покоя и механизмов, обеспечивающих его стабильность. Эти исследования проводятся как на экспериментальном, так и на теоретическом уровне - с помощью математического моделирования физико-химических и электрических свойств возбудимой мембраны.

Известно, что величину потенциала покоя (ППо) можно достаточно корректно выразить с помощью математического уравнения (уравнения Нернста или уравнения Гольдмана-Ходжкина-Катца), включающего ряд переменных параметров. Изменяя произвольно параметры (например, концентрации ионов внутри и снаружи клетки), можно предсказать и проследить на математической модели мембраны, как будет меняться мембранный потенциал в зависимости от выбранных условий.

Знакомство с программой “Neuron”

В Norton Сomander найдите файл (или директорию) под названием NEURON. После того, как вы войдете в программу NEURON, на экране появляется меню, позволяющее выбрать различные режимы, в которых можно с данной программой работать - в зависимости от того, какие свойства предполагается изучать и моделировать - потенциал покоя, потенциал действия, синаптические потенциалы и т.д. (C-CLAMP, V-CLAMP, IA.CCS и другие).

В эксперименте для исследования потенциала покоя и его изменений под действием пропускаемого через мембрану тока (и других факторов) обычно используют внутриклеточную регистрацию сдвигов мембранного потенциала в электрической цепи с помощью микроэлектрода, введенного в клетку. Такой режим работы измерительной цепи носит название режим "фиксации тока" (current clamp). В данной программе этот режим обозначен как C-CLAMP, и именно его мы будем использовать для моделирования изменений ППо, а также ПД. Для перехода в режим C-CLAMP наберите в командной строке

C:\NEURON>C-CLAMP.

После того, как Вы инициируете режим С-CLAMP, на экране появится таблица параметров. Теперь нажмите клавишу О (английский алфавит). На экране в правом углу появится меню файлов. Для работы с ПП₀ найдите файл REST.CCS, перемещая курсор (в виде рамки) с помощью клавиш-стрелок "вверх-вниз", находящихся на правой части панели клавиатуры. Найдя нужный файл, нажмите клавишу “enter”.

Теперь на экране – общее меню-таблица, куда входят многочисленные параметры модельной клетки (нейрона и аксона), а также токов, инъецируемых в нейрон. Эти параметры можно менять (моделировать) произвольно. В левом столбце представлено время, в течение которого происходит развертка луча по горизонтали ("trial duration"), фактически это – общая длительность пробега луча по горизонтали при графическом выражении уровня МП на экране монитора. Эта величина равна 150 мсек, что означает, что именно за это время и будут происходить исследуемые изменения мембранного потенциала. Далее в таблице представлен такой параметр как базовый ток (base current); это – ток, который можно пропускать через мембрану не виде короткой "ступеньки", а постоянно, - для того, чтобы изменить, сдвинуть ПП на все время работы с модельной мембраной. Далее под значками pT и pL в таблице представлены проницаемости для ионов кальция (которые мы не будем использовать).

Еще ниже в левом столбце перечислены некоторые токи, текущие через мембрану при генерации ПД и фиксации мембранного потенциала на определенном уровне. Эти токи представлены в виде соответствующих проводимостей (обозначаемых латинской буквой g); проводимость "g" мембраны (при фиксации потенциала) есть величина, пропорциональная току g =I/V_фикс).

gAHP – это проводимость для кальций-активируемого калиевого тока, (сопровождающего генерацию ПД в нейроне), а активные натриевый и калиевые токи (а точнее - их проводимости при генерации ПД) обозначены в виде соответствующих символов проводимостей – соответственно gNa, gK.

Наконец, два последних параметра, указанные в левом столбце - наиболее важные для моделирования ПП. Это – величины т.н. пассивной проницаемости ("p") мембраны в покое к ионам калия и ионам натрия, обозначенные как pKleakи pNaleak, (Английское слово "leak" переводится на русский как “оттекать”, а “leakage” - "течка". Действительно, - способность катионов калия и натрия мембраны клеток (в состоянии покоя) проходить в обе стороны (внутрь и наружу клетки) через имеющиеся на мембране каналы пассивной проводимости представляет собой не что иное, как пассивную утечку электрического тока, создаваемого этими ионами, двигающимися через мембрану. Поэтому такую проницаемость мембраны к ионам в состоянии покоя часто называют пассивной проницаемостью или утечкой (в отличие от "активной" проницаемости (проводимости) для натрия и калия, возникающих при генерации ПД).

В правом столбце даны концентрации основных потенциал-образующих ионов в наружной среде и во внутренней среде клетки (на примере гигантского аксона кальмара). Концентрации ионов даны в миллимолях. Наружные концентрации ионов, - например, ионов магния, обозначены [Mg]о(буква "о" означает "out" - cнаружи, а внутриклетчные концентрации ионов, - например, ионов калия, обозначены [K]i (буква "i " от английского "inside" - внутри).

При изучении особенностей ПП мы будем изменять пассивные проницаемости мембраны для ионов калия и натрия, а также определять, как меняется ПП при изменении наружных и внутриклеточных концентраций натрия и калия. Соответственно, для этого мы будем использовать и модифицировать следующие параметры (данного меню):

Pk leak ^,pNa leak, [K]o^, [K]i^, [Na]o, [Na]i

В меню даны исходные значения названных параметров, характерные для мембраны гигантского аксона кальмара в состоянии покоя. Из меню видно, что исходная пассивная проницаемость аксона для ионов калия принята за единицу: pKleak=1, а пассивная проницаемость мембраны для натрия при этом - значительно меньше и равна 0,06.

Как известно, в простейшем случае, согласно мембранной теории Ю.Бернштейна (1911), когда в покое мембрана клетки проницаема только для ионов калия, диффузионный потенциал устанавливающийся на мембране, может быть описан количественно с помощью уравнения Нернста:

где:

R - газовая постоянная (постоянная Клайперона) равная 8,314. кулон/градус_*моль,

F - число Фарадея, равное 96 500 кулон/моль,

Т - абсолютная температура, равная величине температуры по шкале Кельвина (то есть 273,16^о К + температура в градусах шкалы Цельсия). Обычно все измерения и расчеты ПП_о проводятся при комнатной температуре, то есть 20оС, поэтому параметр абсолютной температуры составляет 293,16^o.

Важно также отметить, что вместо коэффициента выставляют его численное значение, которое при комнатной температуре Т=20^о С, переходе к десятичному логарифму концентраций ионов и при выражении МП в мВ равно - 57, и в этом случае преобразованное уравнение Нернста, выглядит как:

Именно таким простейшим уравнением можно, например, описать поведение ПП у астроцитов – невозбудимых клеток нейроглии, мембрана которых действительно проницаема только для ионов калия. Однако у подавляющего большинства клеток, и в первую очередь, - у возбудимых клеток, наружная мембрана в состоянии покоя проницаема не только для ионов калия, но и для ионов натрия, и хлора. Поэтому мембранный потенциал (покоя) более корректно описывается уравнением постоянного поля Гольдмана-Ходжкина-Катца:

(I)

где Р ^- коэффициенты проницаемости для ионов, а в прямоугольных скобках концентрации ионов внутри и снаружи клетки

В настоящее время известно, что характер участия ионных потоков калия, натрия и хлора в детерминировании уровня потенциала покоя не одинаков. Ясно, что основными потенциал - образующими ионами являются ионы калия и натрия. Что касается роли ионов хлора, то их участие, как правило, сводится к пассивному распределению и перераспределению между наружной и внутренней средой клетки, в соответствии с уровнем потенциала на мембране (то есть потенциала покоя). (Более подробно о специфической роли ионов калия, натрия и хлора и ионных насосов в детерминировании ППо см. лекционный курс О.П.Балезиной и учебник "Физиология человека” п/р Р.Шмидта и Г.Тевса 1985г. или 1997г. издания).

В соответствии с вышесказанным, уравнение, описывающее реальные факторы, влияющие на ПП₀, часто представляют в виде редуцированного уравнения Гольдмана-Ходжкина-Катца, где ионы хлора опущены и присутствуют лишь параметры проницаемостей и ионные концентрации для натрия и калия:

(2) или (3)

Это уравнение введено в программу NEURON для количественного описания ПП у модельного нейрона, и именно этим уравнением мы будем пользоваться при расчете изменений ПП - в зависимости от изменений ионных проницаемостей, ионных концентраций и трансмембранных ионных градиентов для калия и натрия (пассивные ионные проницаемости в таблице параметров обозначены как pNaleak и pKleak.)

Работа с программой "Потенциал покоя" - "REST.CCS"

Нажмите клавишу "O" (английский шрифт), чтобы открыть необходимый перечень файлов. Используя стрелки (вверх-вниз), сдвигайте верхнюю светящуюся рамку пока на найдете файл REST.CCS. Теперь можно начинать работать в программе "Потенциал покоя".