Ход работы. Вначале выберите новую программу v-clamp

Вначале выберите новую программу v-clamp. Далее мы будем работать с моделью Na_K.VCS ( что означает – Na и K токи в режиме v oltage c lamp s imulation )

Для открытия файла программы Na_K.VCS нажмите клавишу английской буквы " O " (o pen)и найдите в меню, расположенном в правом углу экрана нужный вам файл Na_K.VCS (перемещая курсор вниз по строкам меню). Нажмите "enter". Вы видите перед собой меню – таблицу мембранных параметров проводимости ионных токов, концентраций ионов модельного аксона, а также число, диапазон и параметры инъецируемых через мембрану аксона токов.

Как правило, для анализа токов действия на мембрану подается примерно 150-200 одинаковых деполяризующих ступенек (# of time steps =200) и регистрируются ответы (токи) которые затем усредняются. На рис. 1 показан такой интегральный ток действия, который возникает и течет через мембрану при ее деполяризации и мембране от –100 мВ до 0 и фиксации потенциала на уровне МП= 0 мВ.

Нажмите «В» (команда В egin). Вы видите двухфазный ток – первая, начальная фаза тока направлена вниз –это входящий натриевый ток, а вторая – задержанная фаза – тока имеет противоположное направление – это выходящий из клетки К⁺-ток.

Задание первое. Исследовать изменения тока действия при различных значениях изменениях gNa и gК. Для этого задайте в меню величины gК. Как изменяются кривые тока действия и почему? Задайте в меню величины gNa. Как изменяется кривые тока и почему?

Задание второе. Проведите анализ изменений амплитуды К⁺-тока от трансмембранного градиента ионов К⁺. Постройте график зависимости I _К+макс от K⁺]_нар:

а) при gК= 2нС и К⁺_нар = 0,5 мМ; =1,0мМ; =1,5 мМ; =2мМ; =3,1мМ;

б) при gК= 0.5 нС и К⁺_нар = 0,5 мМ; =1,0мМ; =1,5 мМ; =2мМ; =3,1мМ;

Какой характер носит зависимость I _К+макс от [K]_нар? Как изменился характер зависимости I_K от градиента концентраций при сниженной проводимости потенциал-зависимых К⁺-каналов?

Контрольные вопросы для письменного ответа в тетрадях:

1) чем объясняется кратковременность натриевого тока – почему он быстро спадает, ведь деполяризация мембраны сохраняется?

2) почему К⁺-ток (в отличие от Na⁺-го) не спадает и держится на всем протяжении прикладываемого к мембране деполяризующего тока?

3) перечислите параметры, от которых зависит натриевая и калиевая проводимость мембраны при генерации ПД.

IV. Анализ потенциало-зависимости и взаимодействия активных Na и K токов.

Задание выполняется в программе V-Clamp, режим Na_K. IV. VCS. Нажмите клавишу английской буквы О, далее найдитефайл Na_K. IV. VCS движением курсора вниз до конца по строкам меню.Нажмите ente r. Теперь вы видите меню программы имитирующей ионные – Na⁺ и K⁺ токи, имеющие проводимость gNa () и gK().

Исследуемые токи возникают при возбуждении мембраны и фиксации мембранного потенциала на разных уровнях от –55 мВ до +35 мВ. При нажатии клавиши «В» вы видите картину интегральных токов, текущих через мембрану при фиксации МП на определенном уровне – от –55мВ до +35 мВ (рис.2). Шкала токов дана – в наноамперах, калибровка времени 3мсек.

Для анализа потенциало-зависимости токов используйте режим индивидуальных сдвигов потенциала – на каждые 10мВ, начиная от первого сдвига на 10мВ (от –-65 до –55мВ) и далее – до -45мВ,-35мВ и тд. вплоть до +35 (всего – 10 ступенек деполяризации). Для этого вызывайте токи нажатием клавиши «I» (I ndividual steps). Повторными нажатиями этой клавиши вы сможете увидеть последовательные изменения тока по мере деполяризации мембраны и удерживания ее на уровне МП от –55мВ (первый сдвиг) до +35мВ (последний, десятый сдвиг МП).

Задание 1. Проанализируйте взаимодействие Na⁺ и К⁺ токов возникающих при деполяризации мембраны. Для этого сначала получите семейство интегральных токов нажатием клавиши В. Затем обнулите калиевую проводимость (gK=0), то есть выключите калиевый ток, текущий вместе с натриевым во время генерации ПД. Затем нажмите клавишу Y (наложение) и сравните изменения в токах(в присутствии и в отсутствии калиевого тока) Дайте объяснение, почему не изменилось время нарастания и пиковое значение натриевого тока, но ускорился его спад при деполяризующих толчках до –35 и –25мВ в отсутствии К⁺ тока?

Задание 2. Проведитеанализ потенциал-зависимости Na⁺- тока. О бнулите калиевую проводимость (gK=0). Теперь, нажав клавишу В, вы видите лишь семейство Na⁺ токов, текущих при возбуждении мембраны и фиксации МП на разных уровнях. Используя клавишу I, зарегистрируйте максимальные (пиковые) значения I _Na при разных уровнях фиксации МП. Представьте в отчете вольт-амперную криву ю изменений Na⁺ тока при разных уровнях МП, обозначив на оси абсцисс – уровень фиксированного МП (в мВ), по оси ординат – пиковые значения I_Na при данном МП (в наноамперах). Объясните, с чем связан нелинейный характер вольт-амперной кривой?

Задание2. Для анализа потенциал-зависимости К⁺-тока обнулите натриевую приводимость (gNa=0). Теперь, нажав клавишу В, вы видите лишь семейство К⁺-токов, текущих при возбуждении мембраны и фиксации МП на разных уровнях. Используя клавишу I, зарегистрируйте максимальные (пиковые) значения I_К при разных уровнях фиксации МП. Представьте в отчете вольт-амперную криву ю изменений K⁺ тока при разных уровнях МП, обозначив на оси абсцисс – изменения МП, по оси ординат – пиковые значения I_К. Объясните, чем обусловлен линейный характер вольт-амперной кривой?

Контрольные вопросы для письменного ответа в отчете.

1) Каковы пороги активации Na⁺- и К⁺-тока? Есть ли различия?

2) Каковы времена нарастания Na⁺-тока и K⁺-тока при одинаковых уровнях деполяризации? В чем причина различий во временах нарастания этих токов?

3) Как меняется время нарастания Na⁺-тока по мере деполяризации мембраны от –55 до + 35мВ и почему?

4) Как меняется время спада Na⁺-тока по мере деполяризации и почему?

5) Как выглядят потенциало-зависимость t _нар и t _спада Na⁺-тока?

6) В чем различия между явлениями ин активации Nа⁺-тока и де активации Nа⁺-тока?