Рестриктазы

ЛПЗ № 1. Ферменты генетической инженерии.

Рестриктазы были открыты при изучении явления рестрик­ции и модификации у бактерий, расшифрованного в основном В. Арбером (1968). Рестриктазы узнают определенные последо­вательности нуклеотидов и разрезают двунитевую ДНК на фрагменты. Модификация заклю­чается в метилировании определенных основа­ний в последовательности, узнаваемой сопря­женной рестриктазой; тем самым обеспечивает­ся защита данного участка ДНК от воздействия рестриктазы. Одновременное наличие в клетке этих двух ферментативных активностей (так на­зываемая R-M система) препятствует гидроли­зу собственной нуклеиновой кислоты. Чужерод­ная же ДНК при проникновении в бактериаль­ную клетку служит субстратом для обоих фер­ментов.

Первоначально многие считали, что единст­венной функцией R-M систем является защита клеток от инфицирования фагами. Однако даль­нейшие исследования позволили сделать предположение о том, что R-M системы осуществ­ляют функцию ограничения скрещивания меж­ду различными бактериальными видами и штаммами, которая, однако, не абсолютна и по­зволяет части чужеродной ДНК проникать в клетку, рекомбинационно встраиваться и под­держиваться в качестве генетического фонда для получения эволюционного преимущества. Уместно заметить, что у бактерий весьма проб­лематично определение вида. Существуют да­же предположения об общем генофонде всех микроорганизмов, что должно было бы привес­ти к бесконечному появлению новых видов бак­терий во времени. Реально же мы видим, что бактерии проявляют определенное постоянство морфологических, генетических и биохимиче­ских характеристик: Достойными кандидатами для обеспечения в эволюции относительной стабильности генетического материала, т. е. для осуществления генетической изоляции, не от­рицающей обмена определенными блоками, являются системы рестрикции-модификации.

Системы рестрикции и модификации найдены практически у всех исследованных бактерий. Недавно рестриктазы обнаружены и у некоторых видов дрожжей.

В 1968 г. М. Мезельсон и Р. Юань сообщили о выделении первой рестриктазы из штамма Е. coli К12. Подобный фермент был получен и из штамма Е. coli В. Данные эндонуклеазы ЕсоК и ЕсоВ отличались высокой специфич­ностью по отношению к узнаваемой последова­тельности нуклеотидов, yо расщепляли молекулы ДНК неспецифически в другом месте, от­стоящем от участка (сайта) узнавания. В 1970 г. X. Смит и К. Вилькокс выделили из Haemophius influenzae рестриктазу HindII, не только специ­фически узнающую, но и специфически рас­щепляющую молекулы ДНК. При гидролизе вирусной или плазмидной ДНК рестриктазами такого типа образуется строго определенный на­бор фрагментов. Это наглядно выявляется при электрофоретическом разделении смеси полу­чающихся фрагментов.

Принципиальное значение для разработки методологии генетической инженерии имело от­крытие в 1971 г. Р. Ёшимори рестриктаз EcoR I и EcoR II. С помощью первой из них удалось выполнить пионерскую работу по направленной реконструкции генетического материала in vitro. В настоящее время рестриктазы используют практически во всех генно-инженерных экспе­риментах. Такое широкое применение фермен­тов данного типа обусловлено их высокой спе­цифичностью, а также особенностями структу­ры концов фрагментов ДНК, образуемых рестриктазами. Общепринято термины рестриктаза, эндонуклеаза рестрикции, сайтспецифическая эндодезоксирибонуклеаза считать синонимами.

X. Смит и Д. Натане в 1973 г. предложили номенклатуру рестриктаз, которая включает следующие пункты:

1.Название каждого фермента является про­изводным от бинарного родо-видового обозна­чения микроорганизма-хозяина, содержащего данную R-M систему, и составляется по сле­дующему правилу: к первой прописной букве названия рода добавляют две первые строчные буквы вида. Например: Streploinyces albiis - Sal, Escherichia coli - Eco.

2. За родо-видовым названием следует, в слу­чае необходимости, обозначение серотипа или штамма: Haemophihis influenzae d - Hind. Escherichia coli В - ЕсоВ.

3.Различные системы рестрикции-модифи­кации, кодируемые одной и той же бактериальной клеткой обозначаются римскими цифрами, например: HindI, HindII, HindIII.

4. Ферменты рестрикции-модификации в общем виде обозначаются как эндонуклеаза R или метилаза М с последующим определением
названия системы, например: эндонуклеаза R * HindII или метилаза М * HindII.

5. Если система генетически локализована в геноме фага или на плазмиде, то после родо­-видового названия указывается символ внехромосомного элемента: EcoРI, EcoKII. Штаммовая принадлежность в этих случаях указывает­ся в скобках: Есо(К)РI.

Основные принципы, заложенные в этой номенклатуре, используются и в настоящее вре­мя. Однако неоднозначность в названиях, воз­никшая из-за лавинообразного открытия новых рестриктаз, заставила Р. Робертса в 1978 г. внес­ти некоторые дополнения в вышеописанную систему рациональных обозначений ферментов. Смысл дополнений заключается в том, что во избежание путаницы в случае, когда название совпадает для нескольких ферментов, оставляют неизменными первые две буквы, а третью берут из последующих букв видового названия, напри­мер: Haemophihis parainfluenzae - НраI, Hae­mophilus parahaemolyticus - HphI. Для большей точности Д. Шибата с соавторами предложили после латинской родо-видовой символики вво­дить музейный номер бактериальной культуры, например: Pvu84II, Hinb 10761II.

Открытие большого числа рестриктаз и изу­чение их свойств позволило выявить некоторые закономерности функционирования ферментов и разделить их на три класса. Основой классификации служат в первую очередь потребность фермента в кофакторах и характер расщепления ДНК.

Различают 3 основных класса рестриктаз: 1, 2 и 3. Все рестриктазы узнают на двуспиральной ДНК строго определенные последовательности, но рестриктазы 1-го класса осуществляют разрывы в произвольных точках молекулы ДНК, а рестриктазы 2-го и 3-го классов узнают и расщепляют ДНК в строго определенных точках внутри сайтов узнавания или на фиксированном от них расстоянии.

Ферменты типов 1 и 3 имеют сложную субъединичную структуру и обладают двумя типами активностей - модифицирующей (метилирующей) и АТФ-зависимой эндонуклеазной.

Ферменты второго класса состоят из 2 отдельных белков: рестрицирующей эндонуклеазы и модифицирующей метилазы, поэтому в генной инженерии используются исключительно ферменты 2-го класса. Они нуждаются в ионах магния в качестве кофакторов.

Рестриктазы I класса, к которым относятся, к примеру, ферменты ЕсоК, EcoB, EcoPl и другие, атакуют ДНК в произвольных местах и образуют сплош­ной спектр рестриктов. Эти рестриктазы в генетической инженерии не исполь­зуются, поскольку с их помощью нельзя получить фрагменты ДНК строго детерминированных размеров.

Рестриктазы класса II. Системы рестрик­ции-модификации класса II состоят из отдель­ных белков рестрикционной эндонуклеазы и модификационной метилазы. Поэтому рестрик­тазы данного класса можно выделить в индиви­дуальном состоянии, свободном от метилазной активности, что в значительной мере упрощает их изучение и последующее использование для расщепления молекул ДНК.

Рестриктазы класса II - относительно прос­то организованные белки, состоящие из двух субъединиц одного типа со сравнительно небольшой молекулярной массой. Отличитель­ной чертой рестриктаз класса II является то, что они узнают и разрезают немодифицированную двухцепочечную молекулу ДНК по специфич­ным нуклеотидным последовательностям, и это приводит к образованию дискретного набора фрагментов анализируемой ДНК.

Рестриктазы класса II обычно узнают последовательности двухцепочечной ДНК длиной от 4 до 8 пн, имеющие ось симметрии второго порядка, - палиндромы. При этом ряд рестриктаз расщепляет ДНК строго по оси симметрии узнаваемой последо­вательности, что приводит к образованию фраг­ментов ДНК с тупыми концами, не имеющими выступающих одноцепочечных участков. Например, рестриктаза AluI, схема участка узнава­ния которой представлена на рис., осу­ществляет гидролиз ДНК следующим образом:

Рис. Строение участка расщепления молекулы ДНК рестриктазой AluI.

Штриховая линия - ось симметрии; стрелками обозначены места гидролиза цепей ДНК

Другой фермент - EcoRI - узнает гексануклеотидную последовательность и расщепля­ет ее с образованием взаимокомплементарных одноцепочечных липких концов:

Кроме выступающих 5'-концов рестрикта­зы могут образовывать также липкие 3'-концы. К подобным ферментам относится рестриктаза PstI:

Ряд рестриктаз узнают частично вырожден­ные последовательности, поэтому такие фер­менты не обладают столь высокой специфич­ностью, как рассмотренные выше.

Размер узнаваемой рестриктазой последо­вательности, как правило, обусловливает час­тоту встречаемости этих участков в природных ДНК. Для случайной последовательности ДНК бесконечной длины с равным содержанием каждого из четырех нуклеотидов вероятность наличия определенной последовательности длиной N (Рn) на молекуле ДНК будет равна 4^-N, причем вырожденность последовательноcти участков узнавания, обнаруженная для некоторых рестриктаз, увеличивает данную вероятность. Средняя частота встречаемости тетрануклеотида - Р₄ = 4^-4 = 3,9 *10^-3, октануклеотида – Р⁸ = 1,2*10^-5. Поэтому рестриктазы, узнающие последовательность из четырех пар; нуклеотидов, часто называют мелкощепящими. а рестриктазы с участком узнавания в шесть и более пар нуклеотидов - крупнощепящими.

К мелкощепящим относятся рестриктазы Hpa II и Alu (из Arthrobacter luteus), к крупнощепящим - Eco R I (из Escherichia coli) и Hind III. Если предположить, что участки узнавания рестриктаз распределены вдоль цепи ДНК случайно, то мишень для ферментов, узнающих последовательность (сайт) из четырех нуклеотидов, должна встречаться в среднем 1 раз через каждые 256 пар оснований, а для ферментов, узнающих шесть нуклеотидов, - через 4096 пар оснований. Если сайт рестрикции окажется внутри гена, то обработка ДНК-рестриктазой приведет к его инактивации. Вероятность такого события очень велика при обработке мелкощепящими рестриктазами и незначительна при применении крупнощепящих эндонуклеаз. Поэтому с целью получения неповрежденного гена расщепление проводят поочередно несколькими крупнощепящими рестриктазами, либо применяют прием "недорестрикции", т.е. рестрикцию проводят в таких условиях, когда происходит расщепление лишь в одном сайте.

Большой интерес для экспериментов по клонированию фрагментов ДНК представляют рестриктазы, которые, обладая разной специ­фичностью, дают при гидролизе ДНК одинако­вые липкие концы.

Целенаправленный поиск эндонуклеаз рест­рикции класса II, обусловленный значением этих ферментов, привел к открытию большого числа новых рестриктаз Новой счи­тается любая рестриктаза найденная в не изу­ченном ранее штамме. Дальнейшие исследова­ния позволяют решить, действительно ли дан­ный фермент узнает новую, последовательность нуклеотидов или же является аналогом уже из­вестной рестриктазы. В том случае, если обна­руженная рестриктаза узнает ране неизвест­ную последовательность, она называется про­тотипам. Однако часто ферменты, выделенные из различных микроорганизмов, узнают одну и ту же последовательность и при гидро­лизе определенной ДНК образуют одинаковый спектр фрагментов. Такие рестриктазы называют изошизомерами.В то же время, узнавая од­ну и ту же последовательность, рестриктазы могут по-разному расщеплять двухценочечную ДНК. Поэтому ферменты, имеющие одинако­вые узнаваемые последовательности и одина­ково их расщепляющие, принято называть истинными изошизомерамн. Например, рестрик­тазы HapII, HpaII, MnoI являются истинными изошизомерами. Рестриктазы же SmaI и ХтаI, а также RsaI и CviII имеют попарно одинаковые узнаваемые последовательности, но расщепляют ДНК различным образом. Та­кие ферменты принято называть ложными изошизомерами.

Рестриктазы класса III имеют некоторое сходство с рестриктазами класса I. Нативный фермент состоит из двух различных субъеди­ниц и бифункционален, т. е. обладает как рестриктазной, так и метилазной активностью. Рест­риктазы класса III узнают несимметричные последовательности длиной 5-6 пн и расщепляют ДНК в стороне от участков узнавания на рассто­янии 24-27 пн, образуя одноцепочечные 5'-концы длиной 2-3 нуклеотида. Для проявления эндонуклеазной активности требуются только АТР и ионы Mg²⁺, a SAM лишь стимулирует ре акцию, причем расщепление ДНК не сопровож­дается гидролизом АТР. При действии ферментов данного класса in vitro не удается исчер­пывающе гидролизовать ДНК. Причины этого пока не ясны.

Распространенность рестриктаз. Рестрик­тазы необычайно широко распространены в ми­ре микроорганизмов. Показано, что рестрикция и модификация не коррелируют с патогенностью. Не обнаружено и зависимости от по­требления кислорода, т. е. R-M системы имеют­ся и в аэробах, и в анаэробах. Строение клеточ­ной стенки также не накладывает ограничений на присутствие систем рестрикции-модифика­ции. Необходимо подчеркнуть, что рестриктазы и метилазы не являются обязательными компонентами клетки. Штаммы, не содержащие R-M систем, иногда называют «нулевыми».

Распространенность рестриктаз в царстве прокариот поставила вопрос о возможности су­ществования R-M систем в эукариотических клетках. Попытки обнаружить у эукариот фер­менты, аналогичные рестриктазам класса II, долгое время не давали положительных резуль­татов. В середине 1980-х гг. появились сообще­ния о выделении специфических эндонуклеаз из Saccharomyces cerevisiae, Pichia membranafaciens, Chlamydomonas reinhardtii. Однако дан­ные ферменты не давали исчерпывающего гидролиза ДНК, чем напоминали рестриктазы класса III.

Всю информацию о рестриктазах и метил-трансферазах можно найти на веб-сайте www.rebase.neb.com, который регулярно обнов­ляется.