|
Питательная среда из зернового отвара
Состав: Зерновой отвар* -100 мл**; агар - 1,5 г.***
* Можно использовать отвар, который остается у Вас после приготовления зерна (если Вы используете зерно в качестве субстрата), но только если зерно варилось без добавления Н2О2. В противном случае, агар попросту не застынет.
**Расход среды на одну 100 мм чашку Петри ~ 30-50 мл.
*** При использовании девятисотого агара.
|
|
Процедура приготовления
Берем около 100 мл зерна (пшеница, рожь, ячмень, овес и т.д.),
|
|
|
высыпаем в емкость,
|
|
|
заливаем 500 мл воды (используется обычная вода из-под крана),
|
|
|
ставим на газ,
|
|
|
доводим до кипения,
|
|
|
делаем маленький огонек, и варим в течение 30 минут.
|
|
|
За это время часть воды выкипит, а оставшаяся часть окрасится в приятный, темно-коричневый цвет.
|
|
|
Получившийся отвар необходимо профильтровать. В качестве фильтра можно использовать сложенную в несколько слоев марлю, или хлопчатобумажную ткань. Их укладывают в сито или воронку и аккуратно выливают отвар.
|
|
|
Зерно и мелкие частицы, оставшиеся на фильтре выбрасывают.
|
|
|
Если количество отвара получилось меньше, чем Вы рассчитывали, доведите его до нужного объема долив необходимое количество воды (используется обычная вода из-под крана).
|
|
|
Получившийся отвар переливаем в небольшую емкость,
|
|
|
ставим на газ, доводим до кипения и уменьшаем огонь.
|
|
|
Добавляем необходимое количество агара, постепенно* высыпая его в кипящий отвар. *(Если агар высыпать сразу, он слипнется в комок, который будет потом очень нелегко растворить в жидкости).
|
|
|
Размешивая, снова доводим отвар до кипения.
|
|
|
Продолжая постоянно помешивать, добиваемся ПОЛНОГО растворения агара. Как только это произойдет - среда готова.
|
|
|
После приготовления, тут же разливаем готовую среду по чашкам Петри. (Чашки Петри сделаны из закаленного стекла, поэтому они не лопнут.)
|
|
|
Наливать среду, следует слоем 3-5 мм.
|
|
|
После этого накрываем чашки Петри,
|
|
|
и установив их одна на другую в какую-нибудь тарелку или блюдце, (так будет удобнее переносить их с места на место),
|
|
|
ставим в скороварку (или кастрюлю),
|
|
|
и стерилизуем в течение 1 часа.
|
|
|
Питательная среда из картофельного отвара
Состав: Картофельный отвар -100 мл; агар - 1,5 г.
|
|
Процедура приготовления
Берем 150 г картофеля,
|
|
|
тщательно отмываем его от земли,
|
|
|
не очищая, нарезаем кубиками ~1х1 см,
|
|
|
высыпаем в емкость,
|
|
|
заливаем 500 мл воды (используется обычная вода из-под крана),
|
|
|
ставим на газ,
|
|
|
доводим до кипения,
|
|
|
делаем маленький огонек, и варим в течение 30 минут.
|
|
|
За это время часть воды выкипит, а оставшаяся часть окрасится в светло-желтый цвет.
Полученный отвар, так же необходимо профильтровать.
|
|
|
С готовым отваром, поступаем точно так же, как и в предыдущем случае.
|
|
|
Изготовление инокуляционной петли
|
|
Берем самую длинную, какую сможем найти иглу (замечательно подходит "набор игл для шитья кукол"),
|
|
|
нагреваем докрасна,
|
|
|
и не очень сильно, расплющиваем молотком 1-2 см ее острия.
|
|
|
Должно получиться что-то подобное.
|
|
|
Зажав самый кончик иглы (5-7 мм) в тисках, загибаем его под прямым углом (буквой "Г"),
|
|
|
и слегка приплющиваем по бокам.*
|
|
|
*Это делается это для того, чтобы обеспечить лучший контакт инокуляционной петли при соприкосновении с поверхностью.
|
|
|
Теперь делаем ручку - оборачиваем противоположенный конец иглы изолентой.
|
|
|
В результате получается вот такая, (очень удобная для работы со спорами) инокуляционная петля.
|
|
|
Инокуляция
|
|
Аккуратно, стараясь не сдвигать крышки, вынимаем чашки Петри из остывшей скороварки, и откачиваем шприцем воду скопившеюся в блюдце.
Конденсат образовавшийся внутри, на крышках чашек Петри, опасности не представляет.
|
|
|
Работы по проведению инокуляции, должны проводиться в стерильных условиях!Для этого, все необходимые инструменты (инокуляционную петлю, скальпель, вату, спирт, горелку и т.д.), а так же приготовленные чашки Петри, переносят в помещение, которое затем, в течение некоторого времени* обрабатывают бактерицидной лампой.
*(30-60 мин., зависит от площади помещения и мощности лампы.)
|
|
Зайдя в помещение, расставляем инструменты так, чтобы нам было удобно работать. Протираем спиртом все поверхности.
|
|
|
Инокуляционную петлю погружаем в спирт,
|
|
|
и прокаливаем ее докрасна над пламенем горелки.
|
|
|
Затем снова погружаем в спирт,
|
|
|
подносим к горелке, и тут же (пока горит спирт) несем петлю к чашке Петри.
|
|
|
Слегкаприоткрыв крышку (не смещая ее в сторону), погружаем инокуляционную петлю в агар*.
*Это делается для того, чтобы инокуляционная петля стала липкой от оставшегося на ней расплавленного агара. (Так же, при этом происходит охлаждение инокуляционной петли до безопасной для спор температуры.)
|
|
|
Сразу же после этого, слегка приоткрыв пакетик с отпечатком, не касаясь его краев, соскребаем инокуляционной петлей часть спор*.
*Если отпечаток хорошего качества, достаточно едва коснуться петлей, чтобы к ней прилипли тысячи спор. Если отпечаток совсем бледный, можно основательно поскрести острым концом инокуляционной петли по бумаге, чтобы вместе с частичками бумаги наверняка захватить часть спор.
|
|
|
После этого, сразу же переносим инокуляционную петлю обратно к чашке Петри, и так же, слегка приоткрыв крышку (не смещая ее в сторону), касаемся поверхности агара в нескольких местах.
|
|
|
Если спор было достаточно много, они будут заметны на поверхности агара. Если спор было мало, на агаре останутся только следы от контакта с инокуляционной петлей. В любом случае, споры попали на питательную среду, в благоприятные условия, и через несколько дней должны прорасти.
|
|
|
Обязательно подписывайте свои чашки Петри (название вида, дату инокуляции и т.д., все, что считаете нужным), иначе потом Вы запутаетесь, что, где растет.
|
|
|
Теперь, чашки Петри необходимо обернуть пищевой пленкой. Это делается для того, чтобы предотвратить проникновение в них посторонних микроорганизмов.
Накладываем пленку поверх чашки Петри,
|
|
|
поднимаем чашку Петри, опуская при этом пленку
|
|
|
и обрезаем ее с небольшим запасом.
|
|
|
Теперь стягиваем края пленки вниз по всему периметру чашки Петри,
|
|
|
и закручиваем их (как фантик).
|
|
|
Закрученные края плотно прижимаем рукой
|
|
|
и в таком виде, убираем чашки Петри в темное, теплое (23-27С) место, на весь период инкубации.
|
|
|
Инкубация
Через 3-10 дней (в зависимости от количества и качества спор) споры прорастают - в местах инокуляции появляется белый пухмицелия.*
* Мицелий любого другого цвета, или консистенции, (например пленка, или слизь) является явным признаком заражения и должен быть немедленно удален.
|
|
|
Через несколько дней, очагов мицелия становится больше, и он продолжает разрастаться.
|
|
|
Очаги мицелия могут появляться не только в местах, контакта с инокуляционной петлей, но и по всей поверхности агара. Это происходит потому, что пока Вы совершали манипуляции внутри чашки Петри, некоторые споры упали с инокуляционной петли сами по себе, и теперь они проросли. Так же, споры могли переместиться в результате движения жидкости (упавшие капли конденсата).
|
|
|
Если во время инкубационного периода, заражения среды посторонними микроорганизмами не происходит, через 3-4 недели, мицелий полностью осваивает поверхность агара.
|
|
|
Хранение культур
|
| После того, как мицелий полностьюосвоит поверхность агара, чашки Петри убирают на хранение в холодильник. При температуре +3-5С процессы жизнедеятельности мицелия замедляются, и он может сохраняться в таких условиях несколько лет. В течение этого времени мицелий постепенно поедает питательную среду, поэтому, чем толще был ее слой, тем дольше мицелий сможет питаться.
По мере надобности, чашки Петри с мицелием достают из холодильника и отрезают кусочки агара для проведения инокуляции*, или для пересадки культуры на свежую питательную среду.**
*Для проведения инокуляции отрезают небольшой (~ 1х1 см) кусочек агара с мицелием и помещают его в емкость с субстратом. Через несколько дней мицелий перебирается на субстрат и постепенно осваивает его целиком. Фото работ по проведению инокуляции кусочками агара, можно посмотреть в иллюстрированном руководстве по выращиванию грибов.
Поскольку для проведения одной инокуляции, достаточно малюсенького кусочка агара, одной 100 мм чашки Петри, хватает на проведение 20-30 инокуляций.
**Такой метод хранения, называется "метод вегетативных пассажей", он позволяет сохранять полученную культуру практически в неизмененном виде. Чем реже происходит пересев, тем меньше клеточных делений претерпевает культура и тем ближе она по своим свойствам к исходному изолянту. Пересадку мицелия на новую среду, в этом случае, рекомендуется проводить не чаще одного раза в год.
Для длительногохранения культур, удобно использовать пробирки со скошенным агаром. Готовую среду разливают по пробиркам, закрывают их ватно-марлевой пробкой, и после стерилизации, пока агар не застыл, устанавливают в наклонном положении - скашивают агар. После того как агар застынет, пробирки инокулируют мицелием, дожидаются полного обрастания поверхности агара, и убирают на хранение в холодильник.
Длительность хранения при этом, достигается за счет уменьшении площади роста мицелия и увеличении толщины питательного слоя (по сравнению с чашкой Петри).
Более подробную информацию о методе хранения культур в пробирках на скошенном агаре, а так же о выделении чистой культуры из плодового тела гриба, Вы сможете найти в тексте "Отечественные техники выращивания грибов в домашних условиях".
|
|
Выделение чистой культуры*
|
|
* Чистая культура - это клетки микроорганизмов одного вида. (В нашем случае, это мицелий культивируемого гриба).
|
|
Если во время роста мицелия, произошло заражение среды посторонними микроорганизмами, необходимо как можно быстрее отделить чистый мицелий, от конкурирующей микрофлоры. Это можно сделать двумя способами.
|
|
1. Удаление очага заражения
В случае "точечного заражения", (когда очаг заражения небольшой и локализован в одном месте), его проще вырезать и выбросить, оставив не тронутой основную часть мицелия.
|
 
|
|
Работы по выделению чистой культуры, должны проводиться в стерильных условиях!
Берем чашку Петри, в которой произошло заражение,
|
|
|
входим с ней в стерильное помещение, протираем все поверхности спиртом, погружаем скальпель в спирт, прокаливаем его над пламенем горелки, снова погружаем в спирт, подносим к горелке, и тут же (пока горит спирт), несем его к чашке Петри.*
*Смотри фото аналогичных действий при работе с инокуляционной петлей.
Слегка приоткрыв крышку (не смещая ее в сторону), вырезаем скальпелем кусок агара, с растущей на нем плесенью,
|
|
|
подцепляем его кончиком скальпеля и удаляем.
|
|
|
Чашку Петри с удаленным очагом заражения оборачиваем пищевой пленкой и убираем в темное, теплое место, на весь период инкубации.*
*Смотри фото аналогичных действий при проведении инокуляции.
|
|
| Если заражения посторонними микроорганизмами не произойдет, через некоторое время (зависит от того, на какой стадии роста мицелия произошло удаление очага заражения), мицелий полностью освоит поверхность агара.
|
|
2. Пересадка мицелия
|
|
В случае, когда посторонняя микрофлора занимает значительную часть, и вырезать ее не представляется возможным, из зараженной чашки Петри извлекают кусочек агара с чистым мицелием, и пересаживают его на новую среду в другую чашку Петри.
|
|
|
Берем чашку Петри, в которой произошло заражение, входим с ней в стерильное помещение, протираем все поверхности спиртом, погружаем скальпель в спирт, прокаливаем его над пламенем горелки, снова погружаем в спирт, подносим к горелке и тут же (пока горит спирт) несем его к чашке Петри.*
*Смотри фото аналогичных действий при работе с инокуляционной петлей.
Слегка приоткрыв крышку (не смещая ее в сторону), вырезаем скальпелем кусочек агара с чистым мицелием,
|
|
|
подцепляем его кончиком скальпеля
|
|
|
и переносим на новую среду, в другую чашку Петри.
|
|
|
Чашку Петри накрываем, подписываем, оборачиваем пищевой пленкой и убираем в темное, теплое место на весь период инкубации.*
*Смотри фото аналогичных действий при проведения инокуляции.
|
|
| Через несколько дней, пересаженный кусочек опушится мицелием, а еще через несколько дней мицелий переберется на новую среду. Если заражения посторонними микроорганизмами не произойдет, через 3-4 недели, мицелий полностью освоит поверхность агара.
|
2015-07-03
6232
