Методы определения водного потенциала и его составляющих

Определение водного потенциала. Существует несколько методов определения водного потенциала, но ни один из них не отличается совершенством и универсальностью. Все методы можно разделить на три типа: 1) компенсационные; 2) методы прямого измерения давления водяного пара над тканью с помощью психрометра; 3) методы с использованием камеры давления.

Компенсационный метод в жидкой фазе основан на погружении на 1 час высечек или срезов ткани в растворы с различным осмотическим потенциалом и подбор раствора с таким осмотическим потенциалом, в котором исследуемый объект не поглощает воду и не отдает ее (то есть с этим раствором ткань находится в состоянии водного равновесия). Осмотический потенциал такого раствора и принимают равным водному потенциалу исследуемого объекта. Для получения достоверных результатов решающее значение имеет правильный выбор осмотически действующих агентов. Они должны быть безвредными и не должны проникать в клетки. Наиболее широко используется сахароза, манит и полиэтиленгликоль (ПЭГ). Более приемлемым для работы является ПЭГ с молекулярной массой 3000 (Нечипоренко, Рыбалова, 1980). Серию растворов с градиентом осмотического потенциала 0,02 МПа готовят разбавлением более концентрированного раствора. О направлении водообмена судят по изменению концентрации раствора после пребывания в нем ткани с помощью рефрактометра (Максимов, Петинов, 1948).

Психрометрический метод основан на измерении разности температур сухого и увлажненного температурных датчиков в среде с определенной упругостью пара. Чем меньше упругость пара, тем выше скорость испарения воды с поверхности датчиков, то есть значительнее его охлаждение. При помещении опытного объекта в закрытую камеру через определенный интервал времени в камере устанавливается равновесная упругость пара, определяемая водным потенциалом ткани. В интервале упругости пара от 96 до 100%, характерном для биологических объектов, зависимость между давлением влаги в системе и дефицитом относительной упругости пара близка к прямолинейной. Поэтому и охлаждение увлажненного датчика пропорционально водному потенциалу исследуемого образца. Точность психрометрического метода при соблюдении определенных мер предосторожности может быть доведена до -10 кПа.

Определения в камере давления. Метод камеры давления может быть использован для измерения водного потенциала любой части растения, имеющей ксилему (листьев, плодов, побегов, части листа с жилкой). При перерезании стебля или черешка натяжение воды в ксилеме устраняется, и ее водный потенциал падает почти до нуля. Вследствие этого клетки, находящиеся ранее в равновесии с ксилемой, в которой существовало натяжение, оттягивают воду из ксилемы и мениск в сосудах несколько втягивается внутрь, отступая от края среза. Внешне приложенное давление повышает потенциал давления клеток, вследствие чего вода из них выдавливается обратно в ксилему. Давление внутри камеры в тот момент, когда раствор, заполняющий сосуды ксилемы, достигает места среза, равно по абсолютной величине, но противоположно по знаку натяжения, которое существовало в ксилеме до того, как был перерезан стебель и, следовательно, водному потенциалу тканей. Метод камеры давления позволяет быстро определить водный статус растения. Однако, результаты сопоставления измерений водного потенциала растений с помощью камеры давления и других методов оказались весьма противоречивыми.

Определение осмотического потенциала. Существует два методических подхода при определении осмотического потенциала: 1) работа ведется с целыми клетками и тканями; 2) с выжатым клеточным соком.

Клеточные методы: плазмолитический и плазмометрический. В первом случае срезы погружают в ряд растворов с постепенно возрастающей концентрацией и через 30 мин просматривают под микроскопом. Отмечают когда протопласт начинает отделяться от клеточной стенки. При начинающемся плазмолизе потенциал давления равен нулю, а осмотический потенциал равен потенциалу раствора, вызывающего начальный плазмолиз. Плазмометрический метод основан на измерении объема клетки и плазмолизированного протопласта при установлении равновесия между клеткой и гипертоническим тестовым раствором. Объемы клеток и протопласта могут быть измерены с помощью окуляра-микрометра достаточно точно, если клетки имеют более или менее правильную геометрическую форму и устанавливается выпуклый плазмолиз.

Определение осмотического потенциала выжатого клеточного сока. Основным источником ошибок этой группы методов является процедура получения клеточного сока из растительной ткани. Полное извлечение осмотически активных веществ возможно только после нарушения избирательной проницаемости клеток. Лучшим способом разрушения мембран считается воздействие низких температур за счет погружения ткани в жидкий азот. Проще фиксировать ткань действием высоких температур (в аппарате Коха в течение 20 мин). Можно фиксировать ткань, действуя хлороформом. Это очень быстрый способ.

Осмотический потенциал выжатого клеточного сока определяют несколькими методами: криоскопический, тензиометрические моды, психрометрический, рефрактометрический. Криоскопическое определение _П является достаточно точным физическим методом, основным на сравнении температуры замерзания раствора (клеточного сока) и чистого растворителя (воды). Проводится определение в микроосмометрах. Тензиометрические методы основаны на зависимости между осмотическим потенциалом раствора и упругостью водяного пара над ним, термопарой разницы температур капель исследуемого и стандартного растворов, вызванной испарением или конденсацией воды во время уравновешивания давления водяного пара. Точность тензиометричеких методов 0,2 – 0,5%. В психрометрическом методе используют термопарный психрометр. При этом исследуют диски фильтровальной бумаги, пропитанные клеточным соком, выжатым из убитой ткани, или же ткань с разрушенными мембранами. Рефрактометрический метод основан на измерении показания лучепреломления выжатого сока с помощью универсального рефрактометра. Однако, в дано случае, надо иметь в виду, что в соке должно преобладать одно вещество (например, сахароза). Точность рефрактометрического метода около 50 кПа.

Определение потенциала давления. Существуют экспериментальные трудности определения гидростатического давления в живой системе. Обычно определяют водный осмотический потенциал, а затем по уравнению водного потенциала рассчитывают потенциал давления. Прямое измерение потенциала давления проводят с использованием микрокапилляров: по изменению объёма воздуха в микрокапилляре при введении в клетку, по введению пузырька воздуха в клетку с помощью микрокапилляра. В последнее время более широко применяют методику с использованием зонда давления. Принцип метода следующий. Стеклянный микрокапилляр заполняют силиконовым маслом до риски вблизи кончика – это исходный уровень масла. При введении кончика капилляра в клетку масло несколько отступает от кончика под действием внутриклеточного давления. При помощи микрометрического винта границу масла доводят до исходного уровня. Именно в этот момент манометр или датчик, преобразующий давление в электрический сигнал, и регистрируют внутриклеточное давление.