Уреазный метод определения мочевины

Мочевинаявляется основной фракцией остаточного азота, определение которой используется в диагностических целях. Синтез ее происходит в печени из аммиака, который образуется при дезаминировании аминоктислот, распада пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов.

Отклонения от нормального содержания мочевины в сыворотке крови зависит от скорости процессов синтеза мочевины и ее выделения. Увеличение содержания мочевины в сыворотке крови является одним из главных признаков нарушения почек. Из фракций остаточного азота раньше всего повышается уровень мочевины. При почечной недостаточности азот мочевины может составлять до 90% фракций остаточного азота.

Повышение уровня мочевины сыворотки крови может носить и внепеченочный характер: при потере жидкости, при усиленном распаде белков (острая атрофия печени, тяжелые печени) из-за нарушения синтеза мочевины в печени.

Принцип метода: Мочевина под действием уреазы разлагается с образованием аммиака и углекислого газа. Для уреазы мочевина является единственным субстратом, поэтому уреазные методы высокоспецифичны. Выделившийся аммиак образует с гипохлоритом натрия и фенолом окрашенный продукт – индофенол (синего цвета). Интенсивность окраски пропорциональна содержанию мочевины.

Реактивы:

1.Уреаза.

2. Этилендиамин-N (N-тетрауксусной кислоты динатриевая соль).

3 ЭДТА – буфер рН 6,5: 0,6 г трилона В растворяют в 30-40 мл воды, доводят до рН 6,5 раствором едкого натра и доливают водой до 50 мл.

4. Основной раствор уреазы в буфере: 20 мг уреазы растворяют в 10 мл буфера.

5. Рабочий раствор уреазы - перед началом определения берут необходимое количество основного раствора и разводят бидистиллированной водой в отношении 1:4.

6. Фенол.

7. Натрия нитропруссид 2-водный.

8. Цветной реактив: фенол – 0,11 моль/л, нитропруссид натрия – 0,18 моль/л: 0,0263 г нитропруссида натрия помещают в мерную колбу на 500 мл, приливают примерно 300 мл воды, растворяют при перемешивании. Затем добавляют 5,18 г фенола и доливают водой до метки.

9. Натр едкий 1 моль/л; 0,26 моль/л.

10. Гипохлорид натрия:10 г хлорной извести размешивают в течение 15 минут с 17 мл воды, затем добавляют раствор, состоящий из 17 мл воды и 7 г карбоната натрия. Масса сначала густеет, а затем разжижается. Надосадочную жидкость сливают и фильтруют через промытый водный фильтр. Как только раствор приобретает слабо желтую окраску, добавляют 10 капель 1%-ного раствора крахмала и титруют до обесцвечивания.

11. Основной раствор гипохлорита натрия разводят водой так, чтобы концентрация хлора составляла 0,78 г/л, смешивают с равным объемом 0,26 моль/л раствором едкого натрия (100мл+100мл).

12. Мочевина.

13. Бензойная кислота, 2 г/л (кислоту растворяют при нагревании).

14. Калибровочный раствор мочевины, 0,5 ммоль/л: 15 мг мочевины растворяют в мерной колбе на 500 мл в 2 г/л растворе бензойной кислоты.

Ход определения: Перед определением сыворотку разводят 0,154 моль/л раствором хлорида натрия в отношении 1:9.

Опытная проба: 100 мкл рабочего раствор уреазы вносят в пробирку, добавляют 20 мкл разведенной сыворотки. Закрывают пробкой, перемешивают и инкубируют в течение 15 минут при 37 °С. После инкубации добавляют 300 мкл цветного реактива и 300 мкл рабочего раствора гипохлорита натрия. Перемешивают и инкубируют в течение 20-30 минут при 37 °С. Измеряют экстинкцию в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы.

Холостую пробу обрабатывают так же, как опытную, но вместо сыворотки берут 0,154 моль/л раствор.

Калибровочную пробу обрабатывают так же, как опытную, но вместо сыворотки берут калибровочный раствор мочевины. Измеряют при тех же условиях против холостой пробы.

Расчет ведут по формуле:

Е_оо

Количество мочевины, ммоль/л = -------- х 0,5 х 10

Е_к

Где Е_оо - экстинкция опытной пробы, Е_к – экстинкция калибровочной пробьы: 0,5 - концентрация мочевины в калибровочном растворе ммоль/л, 10 – коэффициент разведения.

Нормальные величины. Сыворотка крови – 2, 5-8,3 ммоль/л, или 20-50 мг/100мл.