Методи перенесення чужинних генів у рослини

Перші експерименти по генетичній трансформації з використанням агробактерій проводили шляхом простого нанесення культури бактерій на раневі поверхні рослин. Пухлини, що утворювалися переносили на безгормональні живильні середовища, які містили антибіотики для елімінації бактерій. Цей спосіб був не дуже зручним у роботі, оскільки припускав використання тільки онкогенних штамів агробактерій, крім того, значну кількість у тканинах пухлини становили нетрансформовані клітини, що ростуть за рахунок фітогормонів, які виділяють трансформанти.

Сучасні методи перенесення нових генів можна розділити на дві групи. До першої групи відносять методи введення генів за допомогою природних векторів (на основі Ті-, Ri-плазмід, вірусів і віроїдів), а до другої – прямі методи введення чужорідної ДНК у геном вищих рослин (пряма трансформація ізольованих протопластів, мікроін’єкції, електропорація, упакування в ліпосоми, біолістика та інші) (Рис. 10).

Серед методів першої групи найчастіше використовують відносно простий і зручний метод “листових дисків”. Суть методу полягає в тому, що із листків рослини нарізають смужки або диски. Їх заражають агробактеріями і сумісно культивують на твердому або рідкому середовищах. Спочатку агробактерія потрапляє до місця пошкодження і приєднується до клітини. Контакт з пошкодженою рослиною “включає” гени vir- і Т-області. Індуктором цих процесів є ацетосирингон пошкоджених частин рослини. Через 4-5 годин починається перенесення Т-ДНК Ті-плазміди в клітину рослини, що закінчується через 8-9 годин від моменту попадання бактерії на поверхню рослини.

Потім диски відмивають від бактерій рідким живильним середовищем з антибіотиком – для елімінації бактерій, трохи підсушують фільтрувальним папером і поміщають на живильні середовища для регенерації, які містять селективний агент для відбору трансгенних регенерантів. Цей метод з незначними модифікаціями з успіхом застосований для генетичної трансформації самих різних видів класу дводольних.

Рис. 10. Два основні методи створення трансгенних рослин:

1 – ДНК; 2 – металічні частинки; 3 – плазміда, яка індукує пухлини; 4 – бактеріальна хромосома; 5 – перенесення ДНК; 6 – ядро; 7 – рослинна хромосома.

Тривалий час вважали, що агробактерії здатні трансформувати тільки клітини голонасінних і дводольних рослин, однак недавно з’явились докази їх здатності трансформувати і однодольні рослини, у тому числі і злаки. Однією із причин, що обмежують агробактеріальну трансформацію злаків, вважали нездатність їхніх клітин до синтезу фенольних сполук, які індукують перенесення Т-ДНК, проте є повідомлення про синтез таких сигнальних молекул у однодольних рослин.

На сьогодні за допомогою генетичної трансформації, опосередкованої A.tumefaciens, отримано трансгенні рослини картоплі, томатів, рапсу, бавовни, льону, соняшника, цукрового буряка, люцерни, моркви, сої, баклажана, суниці, винограду, хризантеми, дурману, осики і тополі, красавки, каланхое, тютюну та інші.

„Пряме перенесення генів” має ряд переваг:

по-перше, зникає потреба вводити рекомбінантну ДНК до складу плазмідної ДНК;

по-друге, прямий метод перенесення генів ефективний для клітин однодольних.

Вперше трансформовані клітинні лінії були отримані після обробки ізольованих протопластів тютюну розчином ПЕГ у присутності Ті–плазміди і ДНК тимуса теляти.

Оптимізація умов проникнення плазмідної ДНК у ізольовані протопласти рослин привела до розробки методу електропорації (деякі автори називають цей метод електропульсацією), який оснований на використанні короткочасних, тривалістю від кількох десятків мікросекунд до кількох десятків мілісекунд, імпульсів електричного струму високої напруги (від 200 до 1500 В/см) у присутності ДНК. Хоча механізм, який приводить до посилення проникнення молекул ДНК ще невідомий, вважають, що в результаті електроімпульсації утворюються тимчасові транспортні канали, через які проникають макромолекули. Метод електропорації дозволив отримувати генетичну трансформацію з ефективністю від 0,01 % до 0,1 % від кількості протопластів, які використовуються у досліді. У деяких випадках ефективність трансформації досягала 10 %.

Головним недоліком методу електропорації є необхідність роботи з ізольованими протопластами, що обмежує його застосування для багатьох сільськогосподарських культур.

Одним із способів подолання цих труднощів є розробка методів генетичної трансформації шляхом мікроін’єкції ДНК у рослинну клітину. Цей метод застосовують для трансформації ізольованих протопластів, багатоклітинних структур (ембріоїдів, меристем, інтактного насіння) і генеративних клітин рослин.

Для мікроін’єкцій використовують мікроголку з зовнішнім діаметром 2 мкм і внутрішнім 1-1,25 мкм. Об’єм ін’єкцій у кожний протопласт становить (1-10)·10^-4 мл, при концентрації ДНК – 0,1-1,0 мкг/мкл.

Метод упаковки ДНК в ліпосоми полягає в інкапсулюванні ДНК у сферичні тільця із фосфоліпідними оболонками, які зливаються безпосередньо з мембраною або поглинаються клітинами (ендоцитоз).

Найперспективнішим на сьогодні, є спосіб генетичної трансформації рослин з використанням установки під назвою „short gun” – „дробовик”, який отримав назву бомбардування мікрочастинками (particle bombardment), або біолістика – біологічна балістика (biolistic transformation). Суть методу полягає в тому, що на частинки металу (вольфраму або золота) діаметром 0,6-1,2 мкм осаджується ДНК, а потім ці частинки розганяють в установці і обстрілюють рослинні тканини. Частинки застрягають всередині рослинної клітини і потім в цих тканинах тестують транзієнтну активність генів, що переносяться. Біолістику можна використати для введення чужорідної ДНК в суспензію рослинних клітин, культури клітин, меристематичні тканини, незрілі зародки, протокорми, колеоптилі і пилок широкого кола рослин: кукурудза, пшениця, ячмінь, батат, соя, тютюн, баклажан, рис, жито, овес та інші (табл. 7).

Таблиця 7

Трансгенні рослини, отримані методом бомбардування різних рослинних клітин мікрочастинками

Крім того, за допомогою цього методу були перенесені гени у хлоропласти і мітохондрії. Однією із переваг генетичної трансформації пластидної ДНК є дуже високий рівень експресії чужорідних генів, що пов’язано з дуже великою кількістю копій (до 50000) хлоропластного геному у клітині.

Варто відзначити, що на сьогодні методи генетичної трансформації використовують для вирішення слідуючих завдань селекції: біологічна фіксація азоту не бобовими рослинами, підвищення ефективності фотосинтезу, створення рослин, стійких до несприятливих факторів середовища, гербіцидів, хвороб і шкідників, підвищення якості рослинного білка. Уже клоновані і вбудовані в геном рослин багато господарськоцінних генів. Серед них гени, що визначають стійкість до вірусної інфекції, гербіцидів, шкідників, несприятливих умов оточуючого середовища. Основні проблеми у цій області досліджень пов’язані з виділенням генів, що кодують названі вище ознаки. Тоді як існуючі способи генетичної трансформації вищих рослин забезпечують можливість отримання трансформантів майже у будь-якого господарсько-цінного виду, хоча умови трансформації потребують оптимізації у кожному конкретному випадку.