Полімеразна ланцюгова реакція

Процес утворення додаткових копій нуклеотидних послідовностей ДНК називають ампліфікацією.

Ампліфікацію ДНК здійснюють шляхом клонування або за допомогою методу полімеразиої ланцюгової реакції (ПЛР). ПЛР є ефективним методом одержання in vitro великої кількості копій специфічних нуклеотидних послідовностей.

У 1985 р. К.Б. Мюлліс опублікував і запатентував метод ПЛР, а через 7 років одержав Нобелівську премію з хімії.

Найважливіші характеристики методу ПЛР:

- специфічність реакції;

- точність синтезу ДНК;

- ефективність.

Для проведення ГІЛР необхідні такі компоненти:

- 2 синтетичних праймери довжиною 1 5 —30 п. н.;

- ДНК-матриця довжиною від 100 до 35000 п. н.;

- термостабільна ДНК-полімераза Тац;

- 4 дезоксирибоуклеотиди: (ІАТФ, сіГТФ, <1ЦТФ, сІТТФ.

ПЛР - це циклічний процес. Кожен цикл маг такі етапи:

1) денатурація ДНК (195”С);

2) ренатурація — приєднання праймерів до ДНК-магриці 0 55'С);

3) синтез ДНК — Taq-пoлiмepaзa добудовує комплементарні ланцюги ДНК (172 — 75"С).

Першому циклу ПЛР передує інкубація суміші за 1 92 — 96’С протягом 0,5 — 10 хв, що супроводжується інактивацією домішок білків. Під час короткочасного нагрівання (протягом 1 —2 хв) відбувається плавлення ДНК, ланцюги ДНК відокремлюються один від одного. Під час охолодження дотемператури 37 — 65'С праймери з’єднуються з комплементарними ділянками ДНК, Taq-полімераза синтезує нові ланцюги ДНК. Для здійснення синтезу ДНК температуру підвищують до 72'С. Після завершення стадії синтезу ДНК цикл ГІЛР повторюють в автоматичному режимі. Кожний цикл ПЛР триває З — 5 хв, повторюється ЗО раундів. Після завершення кожного циклу кількість ДНК подвоюється, досягаючи кількох мкг у реакційній суміші об’ємом 25 - 50 мкл. Стандартний об’єм проби, в якій здійснюється ПЛР, становить 20 - 100 мкл. Під час ПЛР кількість ДНК збільшується, поки не досягне 1012, а потім різко зменшується внаслідок вичерпання субстратів реакції і праймерів. Після завершення останнього циклу ПЛР проби витримують 5 — 10 хв за температури 72”С.

У ГЦР використовують Taq-полімеразу, що стійка до дії високих температур. Цей фермент був виділений із термофільних бактерій Thermus aquaticus, які мешкають у гарячих джерелах. Термостабільна Taq-полімераза проявляє активність за температури 95"С і вище.Л.1. Патрушев одним із перших дослідників у Росії одержав високопродуктивний бактеріальний штам-продуцент термостабільної Taq-полімерази і розробив ефективні методи її очищення (із 100 г біомаси бактерій одержують 2 млн одиниць активності високоочищеного ферменту).

Метод ПЛР дозволяє збільшувати кількість фрагментів ДНК у мільйон разів. За допомогою ПЛР можна ампліфікувати in vitro сегменти ДНК довжиною від 0,1 до 5-7 тис. п. н. і більше. Із геномної ДНК 1 —2 соматичних клітин можна т р и м а ти 102- 105 копій ДНК. Таким чином, ПЛР - це альтернативний метод молекулярного клонування коротких фрагментів ДНК.

Сфери застосування ПЛР:

- діагностика інфекційних захворювань (виявлення патогенних мікроорганізмів у біологічному матеріалі);

- отримання великої кількості специфічних фрагментів ДНК (ампліфікація);

- синтез генів;

- секвенування ДНК;

- виявлення в генах спонтанних мутацій, шо призводять до спадкових захворювань.

Цей метод важливий для судової медицини і діагностики генетичних аномалій плода in utero. Для виявлення генних дефектів здійснюють рестрикційний аналіз: ДНК розрізається ферментами рестрикції, одержані фрагменти розділяються за допомогою гель-єлєктрофорезу, електрофоретичні полоси утворюють певну картину. Якщо є мутації, картина полос змінюватиметься.

У 1992 р. Т. Сано вперше розробив метод імуноПЛР — найбільш чутливий метод виявлення білків т а інших антигенів. Чутливість цього методу у 1000 разів перевищу«;: чутливість імуноферментних методів аналізу. Як зонди для виявлення антигенів використовують кон’югати фрагментів ДНК з антитілами. Якщо в біологічному зразку присутній антиген, він з’єднується з антитілом, сигнал передається на ДНК і здійснюється ПЛР. Отже, синтез ДНК свідчить про наявність антигенів.

4. Методи введення ДНК у клітини. Існують 4 групи методів уведення рекомбінантної ДНК:

- хімічні (використання ліпосом, іонів металів та інших хімічних реагентів);

- фізичні (електропорація, лазерне опромінення);

- механічні (мікроін’єкцїя, балістична трансформація);

- біологічні методи (перенесення генів у процесі вірусної інфекції трансфекція).

Процес поглинання клітинами екзогенної ДНК називається трансформацією.

Ефектнвність трансформації визначають як число трансформантів на 1 мкг уведеної ДНК. Сучасні методи трансформації бактеріальних клітин дозволяють одержати до 107 — 108 трансформантів на 1 мкг плазмідної ДНК.

Клітини, що здагні поглинати чужорідну ДНК, називають компетентними. Кількість компетентних клітин можна збільшити, використовуючи спеціальне поживне середовище або умови культивування.

Частоту трансформації і трансфекції клітин Е.соїі можна підвищити різними способами: тепловий шок, дія іонів металів (Са2+, Rb+). Якщо клітини Е.соїі обробити СаС12 за температури 0 С, а потім підвищити температуру до 42"С і витримувати протягом 1,5 хв, відбувається локальне пошкодження клітинної стінки. Цей метод забезпечує частоту трансформації 103 (на 1000 клітин 1 трансформована).

Для введення рекомбінантної ДНК у клітини тварин і людини використовують ліпосоми. Ліпосоми проникають усередину клітин шляхом єндоцитозу.

Електропорація (короткочасний вплив електричного поля протягом 10 мікроксекунд 100 мілісекунд) дозволяє одержати 10⁹ — 10¹⁰ трансформантів на 1 мкг ДНК. Під дією електричного струму збільшується проникність клітинних мембран. Електропорапію використовують для введення в Е.соїі бактеріальних штучних хромосом. Умови проведення електропорації для різних бактерій відрізняються.

Ефективність трансформації для коротких плазмід становить 10⁹, а для довгих (135 тис. п. н.) — 10⁶.

Лазерне опромінення застосовують для створення мініпор (діаметр 2-120 нм) у мембранах клітин-реципієнтїв рекомбінантної ДНК.

Мікроін’єкції рекомбінантної ДНК здійснюють за допомогою мікроманіпуляторів, оснащених скляними мікрокапілярами, якими проколюють мембрани клітин. Цей метод інтенсивно застосовується під час створення трансгенних тварин. Великі фрагменти ДНК уводять безпосередньо в ядра клітин. З усіх методів трансформації лише мікроін’єкція дозволяє вводити в клітини дозовану кількість молекул ДНК.

Бомбардування клітин мікрочастинками вольфраму, золота або льоду, на поверхні яких міститься рекомбінантна ДНК, називають балістичною трансформацією. Цей метод дозволяє вводити ДНК не лише в ядра, а й у мітохондрії і хлоропласти. Балістична трансформація використовується в генотерапії, для імунізації організму за допомогою ДНК-вакцин, а також для одержання трансгенних рослин і тварин.

Найчастіше в генній інженерії застосовуються біологічні методи введення рекомбінантної ДНК, за яких перенесення генів здійснюється у процесі вірусної інфекції.

Для ідентифікації трансформованих клітин використовують такі методи:

- тестування на резистентність до певних антибіотиків;

- гібридизація із зондом, комплементарним певній ділянці необхідного гена;

- імунологічні тести, виявлення специфічного білка - продукту клонованого гена.

Для перевірки експресії вбудованих генів використовують так звані репортні гени, продукти експресії яких легко виявити. Найчастіше як репортні гени використовують ген зеленого флуоресцентного білка (GFP) або ген β-галактозидази.

β -галактозидаза розщеплює штучний субстрат Хgа1 (5- бром-4-хлор-3-індоліл-D-галактопіранозид) з утворенням продукту реакції блакитного кольору. Бактеріальні колонії, що містять рекомбінантні плазміди з геном β -галактозидази, забарвлені у блакитний колір.