Операції генної інженерії

До основних операцій у методології генетичної інженерії належать такі:

1. Виділення генів із генома донора або їх синтез.

2. Технологія рекомбінантних (гібридних) молекул ДНК та їх клонування.

3. Експресія клонованих генів у реципієнтних клітинах.

Існує три джерела молекул ДНК (генів), що застосовуються у генетичній інженерії. Першим є фрагмент генетичного матеріалу із різних організмів. Другим джерелом можуть бути двохланцюгові дезоксирибонуклеїнові кислоти, одержані на основі одноланцюгової ДНК комплементарної мРНК еукаріотичних організмів (кДНК). Третім джерелом молекули ДНК для клонування є хімічний, точніше, хімічно-ферментативний синтез генів.

Важливішим джерелом генів є геноми різних організмів. Будова та розмір геномів в цілому відображає положення організму в еволюційному ряді. Геном бактерії Е.соіі містить одну кільцеву двохланцюгову молекулу ДНК розміром 5*10⁶ п.н. Це відповідає біля 3 *10⁹ Д. Геном людини і вищих тварин містить в десятки тисяч разів більше ДНК, розподіленої в декількох десятках хромосом. Кожний індивідуальний ген є маленькою часткою еукаріотичного генома. Розмір генома клітин ссавців біля 10⁹ п.н., а один ген, наприклад, у 5000 п.н., складає тільки 0,00005% всієї ядерної ДНК. Для ідентифікації такої малої кількості матеріалу необхідно мати надійні методи, особливо високоспецифічні зонди, які взаємодіють лише з певними нуклеотидними послідовностями для виділення їх із величезної кількості інших послідовностей. Для цього використовують високомічені радіоактивні РНК- або ДНК- зонди, гібридизація яких з геном реєструється за допомогою радіоавтографії.

При цьому можуть виникати утруднення, пов’язані з одержанням мРНК, яка відповідає специфічному білку, особливо коли білковий продукт присутній у клітині в незначній кількості. Існує декілька методів виділення мРНК, заснованих на використанні її продукту, в тому числі чутливий метод виявлення продуктів синтезу після ін’єкції РНК в овоцити ксенопусу. Ефективний метод виділення ДНК комплементарної мРНК, трансляція якої пригнічується гібридом; в основі методу лежить здатність кДНК пригнічувати трансляцію мРНК, гібридизуючись із нею. В результаті продукт реакції зникає з системи трансляції in vitro.

Раніше саме мРНК використовувалась як донор для виділення генів. Цей метод мав ряд недоліків, а саме: мРНК не буває абсолютно чистою, її важко одержати в достатній кількості. Метод добре підходить для виділення генів мРНК, які представлені великим числом копій, але не може бути використаний у випадку слабоекспресуючих генів. Ще одне утруднення полягає у тому, що часто не вдається одержати мРНК з достатньо високою радіоактивною міткою. Тому, замість мРНК як зонд стали використовувати клоновану кДНК-копію мРНК.

Фрагментування можна проводити двома методами. Один із них - розщеплення рестриктазами. При цьому кожний фрагмент закінчується сайтом пізнання специфічною рестриктазою. Суть другого методу полягає у механічному дробленні ДНК шляхом внесення у неї розривів із частотою, яка визначається умовами фрагментування. У такому випадку місця розривів розташовуються цілком випадково.

При розщепленні рестриктазою всієї ДНК генома частота розривів визначається довжиною послідовності, яка пізнається ферментом. Чим довша така послідовність, тим рідше відбуваються випадкові розриви. Наприклад, імовірність наявності певної послідовності довжиною 4 п.н. складає 0,25⁴ = 1/256, тому фермент, що пізнає таку коротку послідовність, буде вносити розриви у ДНК досить часто. Частота зменшується до 1/1000 для послідовностей 5 п.н. і до 1/4000 для послідовності у 6 п.н. Цей розрахунок базований на припущенні, що кожна основа у ДНК корелюється частотою її присутності.

Розподіл сайтів пізнання ферменту носить випадковий характер стосовно до генома в цілому. Тому обробка еукаріотичної ДНК рестриктазами веде до утворення багаточисельності фрагментів. При електрофорезі в гелі ці фрагменти утворюють пляму, у якій не розрізняються окремі смуги. При наявності специфічного зонду у плямі рестриктів можна виявити відповідні йому послідовності. У послідовності операцій такого методу визначальним моментом є денатурація ДНК з утворенням одноланцюгових фрагментів.

Пряме виділення фрагментів генома, відповідних зонду, пов’язане з практичними труднощами, і для виділення окремих генів використовують ефективний метод зі зворотним порядком стадій, коли спочатку проводять клонування генома. Опісля здійснюють відбір клонів, які містять специфічну послідовність. Вектори, які несуть ДНК, одержану із генома, називають клонами геномної, або хромосомної ДНК (на відміну від клонів кДНК, які є копіями мРНК).