Судак, пораженный фибросаркомой

Приложение 5. Лабораторные методы определения свежести рыбы

Приложение 5

При обнаружении признаков несвежести рыбы проводят бактериоскопию, определяют сероводород с подогреванием пробы и концентрацию водородных ионов (рН), содержание амино-аммиачного азота и продуктов первичного распада белков в бульоне (реакция с сернокислой медью), ставят реакцию на пероксидазу и редуктазную пробу, проводят люминесцентно-спектральный анализ. В необходимых случаях для характеристики пищевых и кормовых достоинств рыбы дополнительно определяют химический состав, биологическую ценность (безвредность, питательность), видовую принадлежность микроорганизмов и содержание влаги в мясе исследуемых рыб. В малооборудованных лабораториях для оценки доброкачественности рыбы ограничиваются бактериоскопией мазков-отпечатков, реакцией на пероксидазу или редуктазу, определением сероводорода, рН и безвредности рыбы.

Бактериоскопия. На предметных стеклах делают два мазка-отпечатка: один - из поверхностных слоев мышц, расположенных под кожей, другой - из мышечной ткани глубоких слоев мышц, находящихся около позвоночника. Приготовленные препараты красят по Граму. Под микроскопом подсчитывают среднее число микроорганизмов в одном поле зрения.

Рыба свежая - в мазках из поверхностных слоев мышц микробов нет или единичные кокки и палочки в нескольких полях зрения. Препарат плохо окрашен, на стекле не заметно остатков разложившейся ткани.

Рыба сомнительной свежести - в мазках из глубоких слоев мышц 10-20, а из поверхностных - 30-50 микробов в одном поле зрения (диплококки, диплобактерии). Препарат окрашен удовлетворительно, на стекле ясно заметны распавшиеся волокна мышечной ткани.

Рыба несвежая - в мазках из глубоких слоев мышц 30-40, а из поверхностных - 80-100 и более микробов в одном поле зрения (преимущественно палочковидных). Препарат хорошо окрашен, на стекле много распавшейся мышечной ткани.

Определение сероводорода с подогреванием пробы. В пробирку (рыхло) помещают 5-7 г фарша мяса рыбы. Под пробку закрепляют полоску фильтровальной бумаги, смоченную 10%-ным щелочным раствором уксусно-кислого свинца. Диаметр капли не более 5 мм. Бумажка не должна прикасаться к мясу и стенкам пробирки. Контролем служит пробирка с фильтровальной бумагой, смоченной дистиллированной водой. Пробирки подогревают на водяной бане при температуре 48-52°С в течение 15 мин и после этого немедленно читают реакцию: рыба свежая - реакция отсутствует (бумага белая, как в контроле); рыба сомнительной свежести - на бумаге появляется слабо-бурое пятно (следы сероводорода); рыба несвежая - цвет капли на бумаге от бурого до темно-коричневого.

Определение концентрации водородных ионов (рН). К 5 г фарша мяса рыбы добавляют 50 мл дистиллированной воды и настаивают 30 мин при периодическом помешивании, фильтруют через бумажный фильтр. Фильтрат используют для исследования. Определяют рН с помощью потенциометра (рН-метра) или индикаторной бумаги. У рыбы свежей фильтрат слегка опалесцирует, рН до 6,9; у рыбы сомнительной свежести - слегка мутноватый, рН 7,0-7,2; у несвежей - мутный, запах неприятный, рН 7,3 и выше.

Определение содержания амино-аммиачного азота. В колбу вместимостью 100 мл к 10 мл профильтрованной через фильтровальную бумагу водной вытяжки из мяса добавляют 40 мл дистиллированной воды и три капли 1%-ного спиртового раствора фенолфталеина. Содержимое колбы нейтрализуют децинормальным раствором натра едкого до слабо-розового окрашивания. Затем в колбу добавляют 10 мл формалина, нейтрализованного по фенолфталеину до слабо-розовой окраски. В результате освобождения карбоксильных групп смесь становится кислой и розовый цвет индикатора исчезает. После этого содержимое колбы снова титруют децинормальным раствором натра едкого до слабо-розовой окраски. Так как 1 мл децинормального раствора натра едкого эквивалентен 1,4 мг азота, то количество миллилитров децинормального раствора натра едкого, пошедшего на второе титрование, умножают на 1,4 и получают количество аммиачного азота (в мг) в 10 мл фильтрата мясной вытяжки.

Пресноводная свежая рыба содержит в мясе до 0,69 мг амино-аммиачного азота, рыба сомнительной свежести - 0,7-0,8, а несвежая - свыше 0,81 мг.

Метод определения продуктов первичного распада белков в бульоне (реакция с сернокислой медью). В коническую колбу Эрленмейера на 200 мл помещают 20 г фарша из спинных мышц рыбы, добавляют 60 мл дистиллированной воды и тщательно перемешивают. Колбу накрывают часовым стеклом и нагревают в течение 10 мин в кипящей водяной бане. Затем горячий бульон фильтруют через плотный слой бумажно-ватного фильтра в пробирку, помещенную в стакан с холодной водой. Если в фильтрате остаются хлопья белка, то его снова фильтруют.

После фильтрации 2 мл бульона наливают в пробирку и добавляют три капли 5%-ного раствора сернокислой меди, встряхивают два-три раза и выдерживают 5 мин. Контролем служит бульон в пробирке без добавления сернокислой меди.

Бульон из мяса свежей рыбы слегка мутнеет, из рыбы сомнительной свежести - заметно мутный, а из несвежей - характеризуется образованием хлопьев или выпадением желеобразного сгустка сине-голубого цвета.

Реакция на пероксидазу (бензидиновая проба). В бактериологическую пробирку вносят 2 мл водной вытяжки (1:10) из жаберной ткани и добавляют 5 капель 0,2%-ного спиртового раствора бензидина. Содержимое пробирки взбалтывают, после чего вносят две капли 1%-ного раствора перекиси водорода.

Вытяжка из жаберной ткани свежих рыб дает синюю окраску, переходящую за 1-2 мин в коричневую.

Вытяжка из жаберной ткани рыб сомнительной свежести дает менее интенсивную окраску и значительно позже переходит в коричневую (через 3-4 мин).

Вытяжка из жаберной ткани несвежей рыбы не дает синей окраски, а непосредственно переходит в коричневый цвет (отрицательная реакция на пероксидазу).

Редуктазная проба. В бактериологическую пробирку вносят 5 г фарша из мяса рыбы, заливают двойным количеством дистиллированной воды, встряхивают и оставляют на 30 мин. Затем приливают 1 мл 0,1%-ного водного раствора метиленового голубого, пробирку энергично встряхивают для равномерной окраски фарша, заливают слоем вазелинового масла толщиной 0,5-1 см. Смесь помещают в термостат при 37°С и периодически ведут наблюдение за обесцвечиванием экстракта. Чем быстрее произойдет обесцвечивание вытяжки из рыбы, к которой добавлен метиленовый голубой, тем больше содержится в ней фермента редуктазы (дегидразы), а следовательно, и больше микроорганизмов, его продуцирующих.

Оценка результатов


Время обесцвечивания	Количество микробов в 1 г мяса	Санитарная оценка рыбы
До 40 мин	10 и выше	Недоброкачественная
40 мин - 2,5 ч	10 -10	Сомнительной свежести
2,5-5 ч или не обесцвечивается	До 10	Свежая

Примечание. При учете результатов реакции сохранение синего кольца под слоем вазелинового масла в расчет не принимать.

Люминесцентно-спектральный анализ. Исследуют под люминесцентным микроскопом непосредственно кусочки глубоких слоев спинных мышц. Под действием ультрафиолетовых лучей длиной волны 360-370 нм мышечная ткань только что убитых рыб флюоресцирует сине-голубоватым цветом, а капельки крови дают темно-коричневую окраску.

При хранении рыбы без воды в течение 10 ч при комнатной температуре окраска мышечной ткани и крови приобретает более интенсивный оттенок.

У рыб сомнительной свежести мышцы светятся тускло-синеватым цветом с фиолетовым оттенком или серо-синеватым со слабым желтоватым оттенком. Кровь флюоресцирует светло-коричневым цветом.

Мясо несвежих рыб светится тусклым сине-голубым цветом с желто-зеленоватым оттенком. Кровь имеет оранжевое свечение.

Определение безвредности (токсичности) и питательной ценности рыбы. Проводят экспрессный микрометод.токсико-биологической оценки рыбы и других гидробионтов, изложенный в приложении 3 настоящих правил.

Определение содержания влаги в мясе рыбы. Содержание влаги определяют высушиванием проб мяса в сушильном шкафу при 105°С до постоянной массы сухого вещества. С этой целью отвешивают пробы массой 5 г, раскладывают в предварительно взвешенные сухие чашки Петри и помещают в сушильный шкаф. На протяжении двух-трех дней проводят три-четыре взвешивания чашек Петри с пробами мяса. Перед взвешиванием чашки с пробами охлаждают в эксикаторах с концентрированной серной кислотой. Анализ считается законченным, если результаты двух последних взвешиваний не превышают предыдущих (

0,01 г).

Влагу вычисляют путем разности массы чашки с пробой мяса до высушивания и после него. Содержание ее выражают в процентах в 100 г сырой ткани.

Определяют влагу каждой пробы в трех повторностях и за конечный результат принимают среднее.

Контролем для сравнения служат средние данные по содержанию влаги в мясе пресноводных рыб (78-79%), а более точный контроль - результаты одновременного определения влаги в мясе только что убитых рыб того же вида и возраста, что и вынужденно исследуемых.

Чем выше общее количество воды в мясе рыбы, тем ниже ее качество. Такая рыба начинает быстро разлагаться.

Неживая рыба при хранении в воде легко впитывает (имбибирует) жидкость. Снулые карпы через 20 ч увеличивают массу на 2-3%, растительноядные - до 5%. Увеличение массы на 1-2% за счет оводнения мышц отмечается у живых ослабленных рыб: больных, отравленных, утомленных, травмированных, выращиваемых в плохих гидрохимических условиях.

Идентификация токсинов клостридий перфрингенс при помощи реакции гемолиза. Сущность ее состоит в том, что при наличии в исследуемом материале или культуре токсинов клостридий перфрингенс происходит их нейтрализация при добавлении гомологичных антитоксических сывороток и гемолиз эритроцитов не наступает. Реакция позволяет определить наличие гемотоксина клостридий перфрингенс и установить его специфичность нейтрализацией типоспецифическими антисыворотками.

Пробы отбирают согласно ГОСТ 21237-75 "Мясо. Методы бактериологического анализа". Стерильную навеску 10 г подвергают (в стерильных условиях) гомогенизации или растирают в стерильной ступке. Из полученного гомогената делают посевы на среду Китта-Тароцци и готовят суспензию на стерильном физиологическом растворе для реакции гемолиза.

Ставят реакцию следующим образом. Берут ряд агглютинационных пробирок (число их зависит от объема работы), в которые разливают по 0,5 мл 2,5%-ной взвеси отмытых физиологическим раствором эритроцитов барана. В одну из пробирок добавляют 0,5 мл исследуемой суспензии и 0,2 мл физиологического раствора (контроль), а в другие - 0,5 мл исследуемой суспензии и 0,2 мл соответствующей антитоксической сыворотки клостридий перфрингенс типов А, В, С, D, выпускаемых в нашей стране. Смесь исследуемой суспензии с антитоксической сывороткой для нейтрализации гемолизина вначале выдерживают 30 мин в термостате при 37°С, рН реакционной смеси 7.

После смешивания всех компонентов пробирки встряхивают и ставят на 2 ч в термостат при температуре 37°С, а затем выдерживают 24 ч при комнатной температуре.

Результаты реакции регистрируют через 2 и 24 ч. Интенсивность ее обозначают крестами (табл.).

Выявление токсинов клостридий перфрингенс при помощи реакции гемолиза


Типы	Результат реакции гемолиза
клостридий	без сыво-	с антитоксическими сыворотками
перфрингенс	роток	против клостридий перфрингенс	противоботулиническими
		А	В	С	D	А	В	С	Е
А	++++	-	-	++++	++++	++++	++++	++++	++++
В	++++	++++	-	-	++++	++++	++++	++++	++++
С	++++	++++	-	-	++++	++++	++++	++++	++++
D	++++	++++	-	++++	-	++++	++++	++++	++++

Примечание. ++++ - Полный гемолиз эритроцитов; - - отсутствие его.

Выращенные 18-часовые культуры клостридий перфрингенс центрифугируют при 6000 об/мин и с полученным центрифугатом ставят реакцию гемолиза на выявление токсина по описанной выше методике. Для контроля в реакции нейтрализации можно использовать противоботулинические сыворотки.

О наличии токсина клостридий перфрингенс и его типовой принадлежности судят по отсутствию реакции гемолиза (нейтрализованный токсин реакции гемолиза не вызывает).

Антитоксическая сыворотка клостридий перфрингенс типа А нейтрализует только токсин клостридий перфрингенс типа А; антитоксическая сыворотка клостридий типа D нейтрализует только токсин типа D; антитоксическая сыворотка клостридий перфрингенс типа В нейтрализует токсин клостридий перфрингенс типов А, В, С и D; антитоксические сыворотки клостридий перфрингенс типов В и С нейтрализуют друг друга. Противоботулинические сыворотки не вызывают нейтрализации токсинов клостридий перфрингенс.

Метод очень прост по технике выполнения и может быть использован даже в недостаточно оборудованных лабораториях. Схема постановки реакции гемолиза и ее результат приведены в таблице.

Идентификация клостридий ботулинум и клостридий перфрингенс люминесцентно-серологическим методом. Для экспрессной идентификации клостридий ботулинум и клостридий перфрингенс рекомендуется люминесцентно-серологический метод.

В исследованиях используют непрямой метод люминесцирующих антител. Берут сухие ослиные против глобулинов кролика люминесцирующие сыворотки, изготовляемые Институтом эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф.Гамалеи. В качестве иммунных (промежуточных) используют противоботулинические и антиперфрингенс типоспецифические агглютинирующие сыворотки.

Мазки для обработки методом непрямой иммунофлуоресцентной окраски готовят непосредственно из мышц рыб (мазки-отпечатки) или из отмытых двух-трехсуточных культур клостридий ботулинум и 16-18-часовых культур клостридий перфрингенс, выращенных на среде Китта-Тароцци.

После подсушивания на воздухе мазки фиксируют в метиловом спирте 5-10 мин. Затем на препараты наносят гомологичные для каждого типа клостридий иммунные сыворотки в их рабочем разведении и помещают на 20 мин во влажную камеру при 37°С. После этого препараты промывают два раза по 10 мин 0,15 н. раствором поваренной соли (рН 7,2-7,4).

Обработанные на первом этапе мазки окрашивают 20 мин люминесцирующей антивидовой сывороткой в разведении 1:32 в условиях влажной камеры. В дальнейшем мазки тщательно промывают 0,15 н. раствором поваренной соли (рН 7,2-7,4), ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе.

Приготовленные препараты просматривают под люминесцентным микроскопом МЛ-2 с использованием светофильтров ФС-1-4; СЗС-7-2; ВС-8,2; запирающего светофильтра Т-2-Н; масляной иммерсии 90x1,25, окуляров 5 , 7 и 10 при силе тока 4,5-5,5 ампера.

У всех типов клостридий ботулинум и клостридий перфрингенс, обработанных соответствующими компонентами непрямого метода иммунофлуоресцентной окраски, наблюдается специфическое (феномен "светящегося ободка") ярко-зеленое (++++) или зеленое средней яркости (+++) свечение вегетативных, споровых и спорообразующих форм клостридий. Наличие яркого светящегося ободка вокруг микробной клетки свидетельствует о специфичности реакции иммунофлуоресценции. У клостридий ботулинум типов А и В, обработанных перекрестно соответствующими сыворотками, отмечается свечение с одинаковой интенсивностью (++++) или (+++), в то время как у других типов клостридий перфрингенс ботулинум (С, D, Е) и клостридий перфрингенс типов А, В, С, D наблюдается специфическое свечение только при обработке гомологичными иммунными сыворотками.

Интенсивность и специфичность свечения клостридий не зависит от биохимической активности и токсигенности микроорганизмов. Свечения других видов микроорганизмов не наблюдается или различаются темные тени микробных клеток на серо-зеленом фоне (+ -).

Для того чтобы получить положительный результат, достаточно в поле зрения микроскопа трех-четырех искомых микробных клеток.

Однако лучшие результаты достигаются при центрифугировании суспензии исследуемого материала с целью концентрации микроорганизмов (5000 об/мин).

С помощью люминесцентно-серологического метода продолжительность исследования на наличие и типизацию клостридий ботулинум и клостридий перфрингенс в мазках-отпечатках сокращается до 3 ч, а с подращиванием на питательной среде Китта-Тароцци - до 48-72 и 16-18 ч соответственно против 6-14 суток существующими классическими методами бактериологического исследования.

Приложение 6. Болезни человека, источниками возбудителей которых являются пресноводная рыба и раки

Приложение 6


Болезни человека и наиболее характерные симптомы	Возбудитель	Пути заражения человека	Патогенность для водных организмов	Меры борьбы
Ботулизм: симптомы невралгического характера и очень высокая смертность*	Клостридии ботулизма	Употребление в пищу сырой или недостаточно тщательно приготовленной зараженной рыбы, в том числе вяленой, соленой, сушеной, копченой, маринованной	Токсин может вызвать гибель	Соблюдение санитарно- гигиенических норм в водоемах. Правильная обработка продукта. Приготовление непосредственно перед употреблением в пищу. Лов, обработка, транспортировка и хранение рыбы в гигиенических условиях
Брюшной тиф: септицемия* сальмонеллез:* гастроэнтерит	Сальмонеллы	Употребление сырой или недостаточно тщательно приготовленной зараженной рыбы	Непатогенны	Санитарное удаление сточных вод. Лов, обработка, транспортировка и хранение рыбы в гигиенических условиях. Правильное охлаждение и тепловая обработка. Соблюдение санитарных норм в водоемах
Гастроэнтерит*	Кишечная палочка	То же	Непатогенна	Аналогичны при сальмонеплезах
Стафилококковая интоксикация: тошнота, рвота, боли в животе, слабость*	Золотистый стафилококк	"	Непатогенен	Лов, обработка, транспортировка и хранение рыбы в гигиенических условиях. Надлежащее приготовление
Диарея, боли в животе*	Клостридии перфрингенс	Употребление в пищу зараженной рыбы, не подвергшейся надлежащему охлаждению и недостаточно тщательно приготовленной	Непатогенны	Лов, обработка, транспортировка и хранение рыбы в гигиенических условиях. Быстрое охлаждение пищевого продукта после приготовления
Рожа: сильное воспаление поверхностных повреждений кожи*	Рожистая палочка	В результате кожных повреждений	Непатогенна	Соблюдение санитарно- гигиенических норм в водоемах. Осторожность при обращении с рыбой
Лептоспироз (инфекционная желтуха)*	Лептоспиры	То же	Непатогенны	То же
Инфекционный гепатит*	Вирус инфекцион- ного гепатита	Употребление в пищу сырой или недостаточно тщательно приготовленной зараженной рыбы	Непатогенны	Соблюдение санитарно- гигиенических норм в водоемах. Правильное приготовление пищи
Описторхоз: цирроз печени	Сосальщик описторхис фелинеус (кошачья двуустка)	То же	Инцистирова- ние в мышцу и кожу	Санитарное удаление нечистот. Уничтожение брюхоногих моллюсков. Правильное приготовление пищи. Достаточное замораживание, правильный посол рыбы
Клонорхоз: признаки и симптомы связаны с поражением печени	Сосальщик клонорхис синензис (печеночная двуустка)	Употребление в пищу сырой или недостаточно тщательно приготовленной зараженной рыбы, в том числе вяленой, соленой, маринованной	Инцистиро- вание в мышечную ткань	Аналогичны при описторхозе
Гетерофоз: боли в животе, диарея со слизью, яйца могут быть обнаружены в головном мозге, сердце и т.д., что сопряжено с атипичными симптомами	Сосальщик гетерофиес гетерофиес	Употребление в пищу сырой или недостаточно тщательно приготовленной зараженной рыбы (нередко соленой и вяленой)	Инцисти-рование в мышцы и кожу	Санитарное удаление нечистот. Уничтожение брюхоногих моллюсков. Правильное приготовление пищи. Достаточное замораживание рыбы
Метагонимоз: гастроэнтерит, упорная диарея	Сосальщик метагонимус	Употребление в пищу сырой или недостаточно тщательно приготовленной зараженной рыбы	Инцистирова- ние в жабры и плавники	Аналогичны при гетерофозе
Дифиллоботроз: тяжелое и опасное заболевание с признаками гастроэнтерита, анемии, слабости	Лентец широкий дифиллобот- риумлятум	То же	Инцистирова- ние в мышцы, гонады (икру), печень	То же
Диоктофимоз: опасное заболевание почек, реже мочевого пузыря и печени	Свайник (великан- диоктофима ренале)	Употребление в пищу сырой или недостаточно тщательно приготовленной зараженной рыбы	Инцистирова- ние в мышечную ткань	"
Парагонимоз: обычно хронический кашель и гемоптизис из-за паразитов, локализовавшихся в легких; могут внедряться в другие органы	Сосальщик парагонимус вастермани (легочная двуустка)	Употребление в пищу сырых или недостаточно тщательно приготовленных зараженных пресноводных раков, использование для питья воды, зараженной метацеркариями сосальщика парагонимус вастермани	Инцистирова- ние в жабры, мышцы, сердце, печень	Санитарное удаление нечистот. Уничтожение брюхоногих моллюсков. Правильное приготовление пищи
Нанофиетоз: исхудание, бледность кожи и слизистых оболочек; при интенсивной инвазии регистрируют боли в животе, чаще диарея, реже запоры, слюнотечение по ночам, головокружение	Трематода нанофиетус сальминкола	Употребление в пищу сырой или недостаточно термически обработанной зараженной пресноводной и проходной рыб	Инцистирова- ние в мышцы, плавники, голову и внутренние органы	Аналогичны при парагонимозе