Клонотека генів. Основні методи скринінга

Технологія рекомбінантних ДНК

МЕТОДИЧНІ ВКАЗІВКИ

до виконання практичних робіт з курсу

для спеціальності 8.092902 „Біотехнологія біологічно активних речовин”,

базового напряму 0929 „Біотехнологія”

Частина 2

Затверджено на засіданні кафедри технології біологічно активних сполук, фармації та біотехнології

Протокол № 8 від 19.02.2009

Львів - 2009

Методичні вказівки до виконання лабораторних робіт з курсу „Технологія рекомбінантних ДНК” спеціальності 8.092902 „Біотехнологія біологічно активних речовин”, базового напряму 0929 „Біотехнологія”/ Упорядники: Заярнюк Н.Л., Червецова В.Г., Федорова О. В., Новіков В.П. – Львів: Видавництво Національного університету “Львівська політехніка”, 2009 – с.40

Укладачі Заярнюк Н.Л., асист.

Червецова В. Г., канд.біол.наук, доц.

Федорова О.В., канд. хім. наук, асист.

Новіков В.П. д-р хім.наук., проф.

Відповідальний за випуск Новіков В.П. д-р хім.наук.,

проф., зав.кафедри ТБСФБ

Рецензенти Комаровська - Порохнявець О.З., канд.хім.наук., ас.

Раєвський Ю.А., канд.техн.наук., доц.

Вступ

Єдність в основних закономірностях зберігання та передачі інформації, універсальність генетичного коду та механізмів експресії генів зробили можливою розробку методик зміни та перенесення генетичної інформації з організму в організм. Клонування генів – це процедура, яка включає виділення та ампліфікацію окремих генів в реципієнтних про- та еукаріотних клітинах. Ці клітини, які містять потрібний нам ген, можна використовувати для одержання великої кількості білку, кодованого цим геном, або для одержання великої кількості самого гену у високоочищеному вигляді.

В теперешній час використовують два методи отримання рекомбінантних ДНК. Відповідно до першого, геномну ДНК розщеплюють довільним чином за допомогою рестриктаз на невеликі фрагменти. Далі кожен фрагмент вводять в складі молекули-вектора в реципієнтну клітину.

Відповідно до другої схеми, з інформаційної РНК знімають копії кодуючої ДНК, які вводять в реципієнтну клітину в складі молекули вектора і розмножують. На даний час використовують в основному другий підхід. Таким чином, творення і скринінг геномної бібліотеки є одним з основних завдань технології рекомбінантних ДНК.

Використання методик технології рекомбінантних ДНК дозволяє вирішувати задачі генної інженерії, а саме: виділяти певні гени, збільшувати їх кількість в клітині, інтенсифікувати їх експресію; конструювати нові гени та одержувати нові білки; розширювати спектр субстратів, що використовуються; створювати нові штами мікроорганізмів, здатних утилізувати шкідливі речовини та покращувати стан навколишнього середовища; одержувати нові організми з цінними властивостями тощо. Ці досягнення знаходять широке застосування в різних галузях народного господарства.

В першій частині методичних вказівок було викладено основні передумови виникнення технології рекомбінантних ДНК, наведено ферменти рестрикції та механізм їх дії, основи визначення нуклеотидної послідовності (секвенування) ДНК.

В другій частині представляються основні особливості створення бібліотек генів, які можливо вважати кінцевим результатом технології рекомбінантних ДНК. Розглядаються найбільш поширені вектори для клонування та процеси введення в них чужорідної ДНК.

В кінці методичних вказівок додається словник термінів.

Клонотека генів. Основні методи скринінга

Клонотека генів (репрезентативна клонотека нуклеотидних послідовностей) – це набір різних послідовностей нуклеотидів, клонованих в складі векторних молекул, що в сумі складають весь геном досліджуваного організму чи його означену частину. Геноми ДНК гідролізують рестриктазами (наприклад Mbo I, сайт дії якої GATC) при певних умовах (час рестрикції, концентрація ферменту). Розміри одержаних фрагментів ДНК повинні відповідати ємності вектора. Наприклад, для клонування в космідах необхідні фрагменти ДНК довжиною 35 – 45 т.п.н., в векторах на основі фага l – 15 – 20 т.п.н., в векторах типу Charon на основі фага λ – 20 – 25 т.п.н., в плазмідних векторах – 1.5 – 3 т.п.н.

В багатьох випадках не виникає необхідності працювати з повними клонотеками генів. Крім унікальних генів в сумарній ДНК існують повтори. Для одержання експресії еукаріотних генів в клітинах прокаріотів, а також для вивчення тканиноспецифічної експресії виникає необхідність одержання кодуючих послідовностей без інтронів. Для цього створюється репрезентативна клонотека кодуючої ДНК, в якій з високою імовірністю представлені послідовності нуклеотидів мРНК, що синтезується в клітинах або тканинах.

Скринінг бібліотеки генів дослівно перекладається як “просіювання” і означає вибір необхідної нуклеотидної послідовності зі зразка ДНК. Всі методи одержання необхідних послідовностей з клонотеки генів можна поділити на прямі і непрямі. В першому випадку досліджують самі рекомбінантні молекули. До непрямих методів відносять імунологічний скринінг та скринінг за активністю білку, що кодується тим геном, який шукають. Для виявлення конкретних нуклеотидних послідовностей проводять гібридизацію досліджуваної ДНК радіоактивним зондом. Досліджувану ДНК денатурують і фіксують на твердій підложці, наприклад нітроцелюлозному або нейлоновому фільтрі. Мічений ДНК – зонд (довжиною від 100 до 1000 нуклеотидів) також денатурують і наносять на фільтр з ДНК. Для гібридизації, тобто утворення стабільного комплексу, необхідно, щоб на ділянці в 50 нуклеотидів співпадало більше 80 %. Для виділення непрореагувавших зондів фільтр промивають та візуалізують мітку, найчастіше радіоавтографією. При необхідності проаналізувати безперервну ділянку ДНК довжиною в декілька сотень тисяч пар нуклеотидів використовують метод, який отримав назву “прогулянка по хромосомі”. Цей метод базується на виділенні короткого кінцевого фрагмента вставки, що міститься в одному з рекомбінантів і використанні цього фрагмента для наступного скринінгу фагової або космідної бібліотеки з метою знаходження рекомбінанта, що містить цей фрагмент разом з сусідньою ділянкою генома. Цей другий рекомбінант використовують для ідентифікації третього і т.д., в наслідок чого утворюється набір фрагментів генома, що перекриваються. Безумовно, короткий фрагмент, який є спільним для двох клонів ДНК, повинен бути унікальним.

При наявності відповідної мРНК або ДНК в якості зонда, структуру індивідуальних генів еукаріотів можна попередньо дослідити клонуванням в бактеріях, використовуючи метод, розроблений Е.Саузерном. В рамках цього метода, що одержав назву “блотінга за Саузерном”, високомолекулярну ДНК розщеплюють рестриктазами і одержані фрагменти розділяють за розміром за допомогою електрофорезу в гелевому шарі. Після цього гель переносять на нітроцелюлозний або нейлоновий фільтр, пропускають через них буферний розчин в напрямку, перпендикулярному до напрямку дії електрофорезу. Утворюється репліка геля на фільтрі. На фільтрі дану ДНК денатурують і гібридизують з радіоактивним ДНК або мРНК зондом. Гібридизаційний сигнал реєструють радіоавтографічним методом. Дуже часто блотінг за Саузерном використовують для попереднього дослідження гена або родини генів з метою вибору оптимальної стратегії клонування.

Аналогічна методика для аналізу м-РНК одержала назву „північного блотінгу”. Сумарну або матричну РНК розділяють за допомогою електрофорезу в присутності сильного денатуруючого агенту (наприклад, формальдегіду), щоб блокувати вплив її вторинної структури на електрофоретичну рухомість. Після цього переносять її на нітроцелюлозний фільтр, де відбувається гібридизація з міченим зондом. Специфічні фрагменти РНК виявляються радіоавтографією. „Північний блотінг” допомагає порівняти розміри м-РНК та відповідної к-ДНК.

Для клонування генів, що кодують білки, які синтезуються в незначних кількостях використовуються спеціальні процедури (наприклад, збагачення м-РНК центрифугуванням в градієнті концентрації сахарози). Одним із методів є гібридизація з радіоактивним зондом молекули ДНК, що кодує цей білок. Якщо відома послідовність амінокислот такого білку можна передбачити нуклеотидні послідовності відповідних м-РНК та к-ДНК і розрахувати, які рестриктази та де саме повинні розщеплювати цю ДНК. В такому випадку скринінг клонованих к-ДНК проводиться з допомогою відповідних рестриктаз.

В якості зондів для певного гену або м-РНК, що кодують білок з визначеною послідовністю амінокислот можна використовувати набір синтетичних олігонуклеотидів. Виходячи з амінокислотної послідовності ділянки білкової молекули довжиною 5-6 амінокислотних залишків для всіх можливих послідовностей м-РНК синтезують відповідний набір комплементарних нуклеотидів, які використовують в якості зонду безпосередньо або як затравки для зворотної транскрипції та синтезу відповідної к-ДНК.