Розв’язання

Необхідно використати вектор, який може реплікуватись в клітинах E.coli. Оскільки довжина фрагменту, що клонується, невелика, можна обрати як вектор плазміду. В складі такої плазміди обов’язково повинні бути: ділянка ori та сильний регульований промотор (наприклад, β-галактозидази). Оскільки, ген проінсуліну містить інтрон, необхідно з допомогою зворотної транскрипції за матрицею м-РНК створити кодуючи ДНК. Кодуючи ДНК необхідно розмістити за промотором β-галактозидази та ініціюючим кодоном ATG, що знаходиться на певній відстані за промотором та ділянкою Шайна-Дальгарно. Це можна зробити без збереження рамки зчитування, тоді утвориться химерна ДНК та химерний білок. Можна розмістити ген проінсуліну після гену β-галактозидази через метіоніновий кодон із збереженням рамки зчитування. Тоді утвориться гібридна ДНК та гібридний білок. Обов’язковою умовою є наявність сигналів термінації одразу після структурної ділянки гену. Вищевказані операції проводяться методами рекомбінантних ДНК (дія рестриктаз, приєднання до кодуючої ДНК „липких” кінців, зшивання з допомогою лігази, скринінг клонотеки генів та інше). Від химерного або гібридного білку проінсулін можна відділити хімічними методами, а зробити з проінсуліну інсулін можна з допомогою дії ферментів.

Примітка. В промисловості ДНК, що кодує інсулін, часто синтезується хімічно, а в якості промотору використовується промотор гену β-лактамази (гену стійкості до ампіциліну) з утворенням гібридного білку, що забезпечує секрецію проінсуліну з бактеріальних клітин завдяки присутності сигнального пептиду на N-кінці β-лактамази.

4. Фермент SOD людини використовується для лікування запальних процесів та зменшення побічної дії від введення інших ферментів. Попередні досліди з клонування к-ДНК проведені в E.coli, але якість одержаного білку була недостатньою у зв’язку з відсутністю сигналів посттрансляційної модифікації. Тому для одержання якісного ферменту к-ДНК була введена в склад експресуючого бінарного вектору для S. cerevisiae. Зобразіть генетичну карту такого вектору, покажіть необхідні ділянки.

Розв’язання.

Дріжджовий бінарний експресуючий вектор обов’язково містить такі ділянки: точку ori та селективний маркер для E.coli (наприклад, ген Аmp), точку ori та послідовності, що забезпечують стабільність позахромосомного існування для S.cerevisiae (S1, S2), дріжджовий селективний маркер (наприклад, ген лейцину Leu), промотор дріжджового гену (G, гліцеральдегідрофосфатдегідрогінази, цей промотор нерегульований, тому синтез ферменту продовжується постійно). К-ДНК розміщена між промотором G та сигналами термінації та поліаденілірування Gp. Всі попередні процедури проводять в E.coli, після чого цим штамом трансформують штам дріжджів, не здатний до синтезу лейцину.

5. Вам необхідно синтезувати поверхневий антиген вірусного гепатиту В в дріжджах Pichia pastoris, використовуючи інтегруючий експресуючий вектор, якщо всі попередні маніпуляції проводяться в E.coli.