2015-10-16
560
Если причина изменения проявления собственных генов растения связана с нарушением целостности генов и их регуляторных элементов, то маркерные гены, входящие в состав переносимых генетических конструкций, будут наследоваться сцепленно с теми генами растения, функционирование которых было нарушено инсерцией. Однако, как показывают экспериментальные данные, лишь 35–40 % видимых нарушений имеют тесное сцепление с трансгенами у трансгенных A. thaliana, проявляющих мутантный фенотип. Сцепленный характер наследования обнаружен только у 6 из 18 трансгенных линий A. thaliana с эпикутикулярным воскообразованием и у 1 из 5 трансформантов с измененной формой листовой пластинки. Таким образом, приведенные примеры убедительно демонстрируют, что нет полной косегрегации измененного признака с признаками, определяемыми маркерными генами. В связи с этим возникает вопрос: что является причиной проявления мутантного фенотипа у оставшейся группы растений?
Причины возникновения мутаций, выявляемых у трансгенных растений, обусловлены не только непосредственной интеграцией Т-ДНК и нарушением целостности генов, но и сложным, не до конца ясным процессом переноса Т-ДНК в растительную клетку. Установлено, что встраивание Т-ДНК может приводить к появлению всего спектра мутаций, описанных классической генетикой, от точечных мутаций, микроделеций и вставок до крупных хромосомных перестроек, таких, как транслокации, инверсии и дупликации. Ткие перестройки могут произойти в результате процессов рекомбинации между районами краевых повторов Т-ДНК и гомологичными участками растительного генома. Инсерции экзогенной ДНК могут быть вырезаны в одном сайте и реинтегрированы в другом, а последовательности растительного генома, фланкирующие Т-ДНК, могут быть делетированы вместе с Т-ДНК и интегрированы в новом районе с образованием транслокации. В ходе репарации района первичной интеграции Т-ДНК возможно образование дуплицированных фрагментов ДНК растения. Известно, что дуплицированные фрагменты с областями гомологии около 90 п.н. могут быть метилированы. Рекомбинация в районе встраивания нескольких Т-ДНК инсерций может приводить к возникновению перестроек в участках растительного генома, фланкирующих многокопийную встройку.
Известны случаи модификации самих фрагментов экзогенной ДНК независимо от способа их переноса. Как при прямом, так и при агробактериальном переносе фрагменты могут быть модифицированы с образованием прямых и инвертированных повторов, а также микроделеций по внутренним и концевым районам. В одной и той же инсерции могут встречаться различные комбинации дупликаций, включая тандемные повторы неполных копий генов. Описаны случаи переноса чужеродной ДНК, связанные с образованием сложного локуса интеграции, в котором последовательности агробактериальной ДНК перемежались фрагментами растительной ДНК.
Проявление мутантного фенотипа у трансформантов может быть связано и с внедрением в растительный геном фрагментов векторной ДНК.
Морфологические мутации
Первой мутацией среди трансгенных растений A. thaliana была мутация dwarf, вызывающая снижение высоты растений. Генетический анализ потомства от самоопыления и возвратного скрещивания выявил тесное сцепление маркерного гена hpt (устойчивость к антибиотику гигромицину) с геном dwarf, контролирующим карликовость у растений A. thaliana,что подтверждало инсерционную природу выделенной мутации. У потомков от самоопыления карликовых растений все растения характеризовались сниженным ростом (карлики). Рекомбинационные события между генами dwarf и hpt не наблюдались, что свидетельствовало о тесном сцеплении изучаемых признаков. Мутация не относилась к группе гормон-зависимых, так как при добавлении в среду или при распылении на листья фитогормонов 2,4-Д индолилуксусной и гиббереллиновой кислот высота растений не изменялась. Частота Т-ДНК-индуцированных мутаций в данном эксперименте составила
19 %. Впоследствии среди 136 трансгенных линий A. thaliana было выявлено 36 линий с такими изменениями, как карликовость, отсутствие трихом на стебле и эмбриолетальность.
Мутант ga4-2, характеризующийся снижением высоты (полукарликовый тип), был выделен среди трансгенных растений A. thaliana, полученных методом агробактериального переноса с использованием корней в качестве эксплантов. Полукарликовый фенотип наследовался как рецессивная мутация, сцепленная с маркерным геном nptII, входящим в состав Т-ДНК-инсерции. Обработка трансформанта раствором гиббереллина приводила к восстановлению дикого фенотипа, что свидетельствовало о гиббереллин-зависимой природе данной мутации.
В литературе на примере трансгенных растений описаны случаи, когда инсерции экзогенной ДНК приводят к мутационным изменениям опосредованно, через индукцию хромосомных перестроек типа транслокаций и инверсий. Так, среди трансгенных растений A. thaliana была выделена линия ACL4, характеризующаяся сильным «сжатием» растений в апикально-базальном направлении. Данная мутация была обозначена TON1 и фенотипически проявлялась в развитии карликовых бесформенных (распластанных) растений. TON1-мутация сцепленно наследовалась с Km-устойчивостью, следовательно, была вызвана инсерцией Т-ДНК.
Рецессивная мутация TFL1 (terminal flower) – слияние цветков на апексе первичного соцветия, описана у трансгенных растений A. Thaliana.. Авторами установлено, что Т-ДНК-встройка в виде четырех тандемно сцепленных копий, организованных как в прямой, так и в обратной ориентации, произошла в район гена tfl1.
Среди трансгенных A. thaliana были выделены три растения с аномальным развитием корней. Растения с мутантным фенотипом формировали короткие корни, сильно увеличенные в диаметре. Только у одного растения наблюдалось сцепленное наследование измененного признака и канамицин-устойчивости. Природа двух других мутаций осталась не ясной. Мутация затрагивала ген SABRE, контролирующий рост клеток кортекса корня в ширину.
Получена серия трансгенных растений A. thaliana с нарушением гравитропического изгиба корня и пониженной чувствительностью к экзогенным ауксинам. Установлено, что мутантный фенотип трех растений обусловлен инсерцией Т-ДНК в район расположения aux1- гена на хромосоме 2. PEL-мутация, обусловливающая аномальное развитие первых листьев у растений A. thaliana, выделена среди 110 независимо полученных трансгенных линий. Интеграция Т-ДНК в область промотора гена pale cress (pac) привела к потере его функциональной активности и нарушила реакцию растений на свет различной интенсивност. При высокой интенсивности света растения погибали на ранних стадиях развития, при меньшей интенсивности – формировали розетку и зацветали, однако не достигали стадии созревания семян и также погибали.
Т-ДНК-инсерция в район промотора гена pif3, кодирующего один из транскрипционных факторов – helix-loop-helix-белок, привела к формированию мутантного фенотипа у трансгенных растений A. thaliana,проявляющегося в формировании короткого гипокотиля при выращивании растений на свету с добавлением пульсирующего красного света.
Среди трансгенных A. thaliana выявлены формы с аномалиями цветков, сходными по проявлению с гомеозисной мутацией apetala2,затрагивающей формирование органов цветка плодолистики.
При агробактериальной трансформации Nicotiana tabacum была получена форма с двойными цветками, волнистыми стеблями и листьями, края которых загибались вверх.
