Культивування генетично трансформованих рослин

Вдосконалення методів маніпулювання рослинними клітинами та збагачення їх сучасними прийомами генетичної інженерії створює в даний час сприятливі умови для поглибленого вив­чення специфіки метаболізму коренів – від поглинання та первинної асиміляції елементів міне­рального живлення до біосинтезу вторинних метаболітів. Ці можливості відкриває нова модельна система – культура генетично трансформованих коренів, одержаних в результаті обробки рослин Agrobacterium rhizogenes. В основі даного методу лежить природний феномен взаємозв'язку між ґрунтовою бактерією та рослинною клітиною, який базується на імплантації в геном рослинної клітини частини тДНК своєї плазміди (Ті-плазміди) агробактерії. Одна з інформацій, яку несе з собою тДНК плазміди, дає змогу клітині самій синтезувати ауксин, що проявляється в утворенні на місці контакту агробактерії і рослини швидко ростучих та інтен­сивно розгалужених коренів, так званих "hairyroots" – "косматих коренів". Цей давно відомий феномен як спеціальний прийом був використаний вперше у 1977 р. з метою індукції органо­генезу галової пухлини Nicotianatabacum. Перехід же до асептичного вирощування ізольова­них, генетично трансформованих коренів було здійснено в1983-1985 pp.

За період з 1985 по 1991 рік в США, Англії, Японії одержано безперервно ростучі (hairy root) культури майже 150 видів дводольних рослин, основну частину яких становлять лікарські рослини. Як відомо, метод культури тканин і клітин рослин має ряд недоліків. Основний з них – віддаленість недиференційованих клітин і тканин як модельних систем та нереальність відтворення повною мірою всіх тих складних процесів, які мають місце в інтактній рослині.

Багаторічний досвід використання методу культури клітин і тканин як моделі вивчення вторинного метаболізму рослин свідчить, що лише невелика кількість рослин в умовах недиференційованого росту in vitro може зберегти здатність до біосинтезу характерних для них вторинних метаболітів.

У цьому відношенні генетична трансформація рослинних клітин Ті-плазмідою A. rhizogenes, яка забезпечує формування типових кореневих структур, що зберігають безперервний ріст при асептичному вирощуванні, дають реальну змогу відтворення біосинтезу в умовах in vitro. Рос­лини родини Solanaceae стали першими, на яких було успішно проведено генетичну трансфор­мацію та були одержані hairy root культури, що синтезують весь спектр коренеспецифічних алкалоїдів.

Інша перевага даного методу – можливість одержання значної біомаси коренів завдяки більш високій ростовій активності їх в такій культурі порівняно з культурою клітин. Ростовий індекс більшості стабільно ростучих кореневих культур становить від 20 до 50 за період 2-3-тижневого культивування. Тому якщо врахувати, що при такому культивуванні концентрація вторинних метаболітів аналогічна цілісній рослині, загальна продуктивність культивова­них коренів може бути значно вищою, ніж продуктивність цілої рослини.

Цей метод виявився чудовою модельною системою для вивчення біогенезу вторинних метаболітів. Цікавою особливістю генетично трансформованих коренів є здатність їх виділяти ендогенні вторинні метаболіти в поживне середовище. Можливо, це зумовлено відсутністю відтоку їх в надземні органи рослини, причому від 10 до 75% їх ендогенного вмісту, що ро­бить перспективним утилізацію поживного середовища в промислових масштабах.

Таким чином, інтенсивний ріст біомаси кореня, де синтезується весь комплекс речовин, характерних для коренів інтактної рослини, здатність їх до росту на відносно простих пожив­них середовищах, екскреція значної частини метаболітів – все це забезпечує культурі гене­тично трансформованих коренів велике майбутнє. Особливо важливе значення цей метод має для України, де спостерігається гострий дефіцит лікарської сировини в умовах екологічного за­бруднення значної території збирання лікарських рослин.

Вдосконалення прийомів генетичної трансформації рослинних клітин значно збагачує арсенал методів фізіолого-біохімічних досліджень новою технологією – культивуванням значної маси коренів з метою одержання цілого ряду метаболітів шляхом використання нових біотехнологій.

Біологічно активні речовини. Генетична інженерія. Фармакогнозія.

Значення культури водоростей в фізіолого-біохімічних дослідженнях і той факт, що вони, як основна фотосинтезуюча ланка екосистем, відіграють найважливішу роль у формуванні і хімічного складу та запасів органічних речовин водойм, посилило інтерес до їх вивчення в ос­танні десятиріччя.

Серед метаболітів водоростей виявлено речовини з алергенним, мутагенним та канцерогенним ефектами, антигормональною, рістстимулюючою, бактерицидною, інсектицидною, фунгіцидною та альгіцидною активністю (Сіренко, Козицька, 1988). В зв'язку з цим, вивчення та препаративне виділення цих сполук має не лише теоретичне, а і велике практичне значен­ня в біотехнології.

За останні тридцять років на хімічно стандартних поживних середовищах вирощували різні види мікроводоростей з метою одержання їх метаболітів, найчастіше вторинних, які мають практичну цінність: Spirulina – джерело цінних білків, вітамінів, вуглеводів та у-лінолевої кисло­ти; Dunallielia – джерело в-каротину та гліцерину; Porphyridium – джерело поліцукрів, арахідо­нової кислоти; Chlamidomonas – джерело поліцукрів, структуроутворювач ґрунту; різні види синьозелених водоростей – азотфіксатори, джерело аміаку.

Ріст біомаси наростаючої культури розпочинається з моменту перенесення частини її на свіже культуральне середовище. Концентрацію біомаси визначають за кількістю клітин, за ма­сою сухої біомаси, чи певного біохімічного компонента.

Ріст культури розподіляють на такі фази: лаг-фаза, фаза прискорення, логарифмічна фаза (збалансований ріст), фаза сповільнення, стаціонарна фаза і фаза відмирання.

В лаг-фазі свіжо висіяна культура проходить адаптацію до культурального середовища, тоді як в наступній фазі прискорення відбувається послідовне зростання певних параметрів біома­си. Спочатку зростає вміст РНК, потім білка і, нарешті, сухої біомаси.

У логарифмічну фазу швидкість росту залишається постійною, а концентрація біомаси зро­стає.

Протягом логарифмічної фази росту співвідношення між різними біохімічними компонен­тами клітин залишається постійним, тому такий стан називають збалансованим або експоненці­альним ростом.

Під час проходження фази сповільнення (або пригнічення) біохімічний склад клітин змінюється в послідовності, протилежній тій, яка спостерігалась у фазу прискорення. В стаціонарній фазі біомаса запишається постійною, але інші її параметри можуть змінюватись.

Кінцева концентрація біомаси, звичайно, тісно пов'язана із збідненням поживного середови­ща, зміною рН, нагромадженням метаболітів, які гальмують ріст культури.

На останній фазі спостерігається зростання відношення дихання до фотосинтезу за межі одиниці, а то й загибель клітин в результаті їх лізису.

Культуру водоростей, виділених в природних умовах, слід постійно підтримувати, захища­ючи її від забруднення.

Завдяки тотипотентності рослинних клітин з трансформованих клітин можуть реге­нерувати повноцінні, здатні до розмноження рослини. Для генетичної трансформації викорис­товують різні типи експлантантів, наприклад висічки листків (leaf discs), сегменти стебла. В даний час цей спосіб перенесення генетичного матеріалу став стандартним в лабораторіях всього світу. Однак, незважаючи на простоту методу, багато видів рослин, серед яких найпоширеніші зернові культури (кукурудза, рис, пшениця), не є природними господарями агробак­терій, тому трансформація їх цим шляхом досить проблематична.

Тому було розпочато пошук альтернативних шляхів і одним з перших кроків до вирішення даної проблеми було введення вільних ДНК в протопласти – рослинні клітини без клітинних стінок.

Початок 90-х років у різних країнах світу ознаменувався розгортанням польових досліджень з генетично модифікованими рослинами. Це – яблуня, малина, горіх, пшениця, соя, горох, цукровий буряк, кукурудза, рис, жито, картопля, помідори, виноград і багато інших. Якщо в 1996 р. площі, на яких вирощували трансгенні рослини складали 3 млн.га, то в 1997 р. – 12 млн.га, в 1998 р. – 26 млн.га, а в 1999 р. – майже 40 мільйонів гектарів (Джеймс, 2000). В Україні такі роботи розпочали академіки К.М. Ситник, Ю.Ю. Глеба і в даний час проводять в різних науково-дослідних установах НАН України та в галузевих інститутах.

Одна з головних проблем, з якими зіткнулась генетична інженерія на початку нового тисячоліття – це насторожене сприйняття громадськістю, особливо деяких розвинених країн Європи, факту появи на полях в різних країнах світу генетично модифікованих рослин та вживання, виготовлених з них продуктів харчування. При визначенні ступеня ризику при ви­користанні трансгенних рослин думки вчених розділилися. Одні вважають, що трансгенні рослини, як і продукти виготовлені з них, безпечні і потрібно ввести лише мінімальний контроль за ними. Прихильники такого погляду вважають, що немає принципових відмінностей між генетичною інженерією і традиційною селекцією, яку здійснює людина. Різниця лише у швидкості процесу досягнення кінцевої мети. На користь доказу безпеки свідчить той факт, що з 1985 р. у світі проведено понад 25000 польових випробувань принаймі 60 різних видів гене­тично трансформованих рослин у 45 країнах і ніяких несприятливих наслідків не спостерігали.

Згідно іншої точки зору, з введенням трансгенних рослин в природне середовище, зростає потенційна небезпека порушення екологічної рівноваги, непередбачуваного пе­ренесення введених генів іншим організмам, зменшення різноманіття сільськогосподарських культур.

Нарешті, є ще одна – крайня точка зору, згідно якої даний напрямок біотехнології має бути забороненим, так як знання про неї ще недостатні, щоб гарантувати повну безпеку.

Більшість вчених єдині у думці, що дослідження з трансгенними організмами потребують ретельного контролю, проте немає підстав вважати, що результати їх можуть бути катастрофіч­ними. Існує необхідність в узгоджених на міжнародному рівні принципів, відповідно до яких буде оцінюватися ризик та здійснюватиметься управління всіма аспектами нових біотехнологій. Необхідно прийняти відповідні закони та впровадити засоби контролю щодо ризику, який виникає при появі генетично трансформованих організмів.

Зелені рослини у процесі фотосинтезу і дальших перетворень здатні створювати будь-які органічні сполуки. Всі ж інші організми, в тому числі й людина, не здатні до самостійного утворення потрібних для життя органічних речовин. Лікувальна дія рослин полягає у єдності і обміну речовин у живих клітинах, адже незважаючи на ряд істотних, відмінностей між рослинами, тваринами та людиною, основні ланки обміну речовин у них подібні. Обмін речовин і енергії може порушуватися через нестачу в раціоні певних речовин, які організм людини сам нездатний синтезувати. Для лікування хвороб нестачі слід в раціон людини вводити певні рослинні продукти, що містять дефіцитну речовину.

Так, пригнічення хвороботворної мікрофлори – бактерій, грибів, вірусів та найпростіших досягається за допомогою речовин, що мають антибіотичну дію. Сильні фітонциди часнику, цибулі, хрону, багатьох пряних рослин "регулюють чисельність і склад кишкової мікрофлори. Ефірні олії лаванди, м'яти, чебрецю, материнки згубні для мікробів, які потрапляють у легені, слизові оболонки.

Мобілізація захисних сил людського організму досягається застосуванням адаптогенів (жень-шень, елеутерокок). Деякі рослинні речовини, зокрема, алкалоїди, активно діють на центральну і вегетативну нервові системи.

Лікувальні властивості рослин залежать від наявності в них різноманітних за хімічною структурою і терапевтичною дією речовин. Найважливішими з них є білки й амінокислоти, нуклеїнові кислоти, алкалоїди, вуглеводи, клітковина, глікозиди, сапоніни, ефірні олії, воски, феноли, флавоноїди, смоли, дубильні речовини, вітаміни тощо (A.M. Ґродзинський, 1992).