Хроматографія амінокислот на папері

Матеріали, реактиви, обладнання: розчин амінокислот (0,1 М розчин лізину і фенілаланіну), Н-бутанол, концентрована оцтова кислота, дистильована вода, 0,5%-ний розчин нінгідрину в ацетоні, хроматографічний папір, ножиці, олівець, лінійка, хроматографічна камера, мікропіпетки, термостат.

Метод хроматографії на папері використовується для визначення амінокислотного складу білків. Він дозволяє протягом декількох годин здійснити розділення суміші амінокислот з якісним і кількісним визначенням їх на хроматограмі.

Для амінокислотного аналізу використовують хроматографічний високоочищений папір. Амінокислоти наносять на смужку паперу близько до краю. Після цього через папір пропускають рухому фазу (суміш органічних розчинників) з боку нанесення амінокислот. Процес хроматографії проводять в закритій камері, повітря якої насичується парами розчинників. При проходженні хроматографії постійно відбувається розподіл амінокислот між рухомою органічною фазою і нерухомою водною, яка підтримується хроматографічним папером. Завдяки такому розподілу метод одержав назву розподільчої хроматографії на папері.

Місце находження різних амінокислот на папері визначається їх коефіцієнтом розподілу α:

,

де С_н – концентрація амінокислоти у водній нерухомій фазі; С_Р – концентрація амінокислоти в органічній рухомій фазі

Чим більше значення α, тим повільніше рухається дана амінокислота. Всі амінокислоти мають індивідуальні значення коефіцієнту розподілу, тому кожна амінокислота переноситься рухомою органічною фазою на певну віддаль від точки нанесення. Ця віддаль для кожної амінокислоти характеризується коефіцієнтом рухливості R_f. Коефіцієнт рухливості – це відношення шляху, пройденого амінокислотою, до довжини шляху, пройденого рухомою фазою:

,

де a – відстань від місця нанесення розчину амінокислот до середини плями даної амінокислоти, мм; b – шлях пройдений розчинником, мм.

Значення R_f для заданих умов хроматографії постійне для кожної амінокислоти і використовується для ідентифікації амінокислот. Розміщення амінокислот на папері після хроматографії виявляють за допомогою нінгідринового реактиву. За розташуванням та інтенсивністю забарвлених плям оцінюють якісний і кількісний амінокислотний склад досліджуваної суміші.

Хід роботи

Підготовка паперу. З аркуша хроматографічного паперу вирізають смужку шириною 5 та довжиною 25 см. На відстані 2 см від нижнього краю проводять лінію, паралельну до краю смужки. На цій лінії позначають дві точки на віддалі 1,5 см від країв смужки. Ці точки служать місцем нанесення розчинів амінокислот.

Нанесення амінокислот на папір. В мікропіпетки з витягнутими носиками набирають по 0,1 мл розчину лізину і фенілаланіну. На точку зліва на смужці паперу наносять розчин суміші амінокислот, а справа – розчин лізину. При цьому потрібно слідкувати, щоб діаметр плями в точці нанесення не перевищував 3-4 мм.

Розділення амінокислот. В хроматографічну камеру на дно наливають 40-50 мл суміші «бутанол – оцтова кислота – вода» у співвідношенні 300:60:140. Після цього в камеру підвішують смужки паперу з нанесеними амінокислотам так, щоб нижній край паперу був занурений у розчин на 0,5-1 см. Камеру закривають і залишають для проходження хроматографії на 1,5 год. За цей час рухома фаза пройде по папері приблизно 10 см.

Проявлення хроматографії та ідентифікація амінокислот. Хроматограму виймають з камери, обережно фіксують олівцем границю фронту рухомої фази і висушують під витяжною шафою. Висушену хроматографу протягують у ванночці, заповненій 0,5%-ним розчином нінгідрину в ацетоні. Після випаровування ацетону хроматограму поміщають в сушильну шафу при температурі 70^оС на 15 хв. Амінокислоти при цьому проявляються у вигляді синьо-фіолетових плям. Причому дві плями будуть розташовуватися на одному рівні – це лізин. Одна пляма фенілаланіну буде знаходитися вище. Для визначення R_f амінокислот вимірюють віддаль (в міліметрах) від точки нанесення до межі фронту органічної фази і віддаль від точки нанесення до центра плями, що відповідає даній амінокислоті. За приведеною вище формулою визначають R_f лізину і фенілаланіну в умовах використаної хроматографічної системи.

Контрольні запитання

1. Класифікація амінокислот. Незамінні амінокислоти.

2. Напишіть дипептид із заданих амінокислот.

3. Назвіть універсальні кольорові реакції на білки і амінокислоти.

4. За допомогою яких реакцій можна встановити присутність тирозину, триптофану?

5. В чому полягає принцип розділення та ідентифікації амінокислот методом хроматографії на папері?