Визначення білків за методом Лоурі

Методи визначення концентрації білків

Мета роботи: ознайомитися з найбільш поширеними методами визначення концентрації білків. Визначити концентрацію білків в заданих зразках.

Теоретичні основи

Для визначення концентрації білків в біохімії використовують ряд методів: метод К’єльдаля, спектрофотометрію в ультрафіолетовій області, колориметрію.

В основу методу К’єльдаля покладено визначення з високою точністю загального азоту в біологічних об’єктах. Не дивлячись на ряд модифікацій за свою багаторічну історію (1883 рік), метод широко використовується в лабораторній практиці і в деяких випадках є стандартом. Для визначення загального азоту за К’єльдалем, органічну речовину мінералізують при високій температурі концентрованою сульфатною кислотою. При цьому органічні речовини окиснюються в присутності каталізатора до СО₂ і Н₂О, а весь азот переходить в аміак і зв’язується з сульфатною кислотою, утворюючи сульфат амонію. Розчином лугу нейтралізують надлишок сульфатної кислоти і звільняють аміак із сульфату амонію, який відганяється парою і зв’язується з розчином борної кислоти. При цьому утворюється борат амонію, який відтитровують стандартним розчином хлоридної або сульфатної кислот. Для розрахунку концентрації білка припускають, що весь азот в досліджуваному об’єкті входить до складу білків. Тоді, знаючи, що азот в білках становить в середньому 16 %, можна визначити концентрацію білка. Метод К’єльдаля забезпечує високу точність при роботі з індивідуальними білками з відомим вмістом азоту. Недоліками методу є велика трудомісткість, він важко піддається автоматизації, довготривалий.

Зручним і швидким способом визначення концентрації білків у розчинах є спектрофотометрія. З амінокислот, які входять до складу білків, дві (триптофан, тирозин) і в меншій мірі фенілаланін поглинають в ультрафіолетовій області спектру. Оптична густина розчині білків, що містять вказані амінокислоти, при 280 нм прямо пропорційна їх концентрації в розчині. Цей метод дає добрі результати з гетерогенними білками, а також з препаратами індивідуальних білків, для яких відомі молярні коефіцієнти оптичної густини. Коефіцієнт оптичної густини даного білку залежить від вмісту в ньому триптофану, тирозину і фенілаланіну. Якщо коефіцієнт білка невідомий, тоді можна скористатися номограмою Адамса. На номограмі на шкалах відкладені значення оптичної густини розчинів при 280 і 260 нм, а також концентрація білка в мг/мл. Визначивши оптичну густину досліджуваного розчину білка при 280 і 260 нм, можна по номограмах визначити його концентрацію. При використанні номограми Адамса також враховується забруднення розчину білків нуклеїновими кислотами, які мають максимум при 260 нм.

В основу колориметричних методів покладені кольорові реакції на білки. Найвідомішими колориметричними методами визначення концентрації є біуретовий і метод Лоурі.

Біуретовий метод базується на реакції білків у лужному середовищі з сульфатом купруму. При цьому появляється фіолетове забарвлення, інтенсивність якого (визначається за допомогою фотоелектроколориметра) прямо пропорційна концентрації білків в розчині. Метод не набув широкого застосування через малу чутливість.

Метод Лоурі є поширенішим завдяки високій чутливості і простоті виконання. Метод оснований на утворенні забарвлених продуктів синього кольору, що утворюються в результаті двох самостійних реакцій::

1) біуретової реакції і іонами купруму в лужному середовищі;

2) реакції відновлення фосфорномолібденової і фосфорновольфрамової солей реактиву Фроліна-Чекальтеу амінокислотами тирозином і триптофаном.

Метод Лоурі приблизно в 100 раз чутливіший від біуретового методу, в 10-20 разів від спектрофотометричного. Метод Лоури зважаючи на його високу чутливість зазвичай використовують для визначення низьких концентрацій білку (в межах 10–60 мг/л). Недоліком методу Лоурі є його менша специфічність, ніж біуретового. На інтенсивність забарвлення впливають ряд речовин, які можуть міститися в розчинах білків (тріс-буфер, цистеїн, дитіотреітол, аскорбінова кислота, сульфат амонію, детергенти, сахароза в концентрації 10 %). Тому при визначенні концентрації білка в розчинах з названими речовинами необхідно робити відповідний контроль або попередній діаліз.

Визначення білків за методом Лоурі.

Матеріали, реактиви і обладнання: розчини білків з невідомою концентрацією, стандартний розчин білка (БСА, 2 мг/мл), реактив Фоліна-Чекальтеу (1 Н розчин), 10% розчин Na₂CO₃ в 0,5 М NaOH (реактив 1), 0,5 % CuSO₄ (реактив 2), штатив з пробірками, піпетки, фотометр КФК-3.

Приготування реактиву Фоліна-Чекальтеу. В круглодонну колбу на 1,5-2 л вносять 100 г Na₂WO₄·2H₂O і 25 г Na₂MoO₄·2H₂O і розчиняють їх в 700 мл дистильованої води. До розчину додають 50 мл 80 %-ного розчину ортофосфатної кислоти і 100 мл концентрованої хлоридної кислоти. До колби приєднують зворотний холодильник і кип’ятять протягом 10 годин, потім додають 150 г Li₂SO₄, 50 мл води і 2-3 краплі брому. Кип’ятять без холодильника 15 хвилин для видалення надлишку брому. Після цього розчин охолоджують до кімнатної температури, доводять об’єм до 1 літра водою і фільтрують. Одержаний розчин повинен бути яскраво-жовтого кольору. Його зберігають в темному посуді і перед використанням розводять дистильованою водою 1:1.

Хід роботи

До 0,6 мл розчину, що мітить білок, додають 3 мл робочого розчину (робочий розчин готується в день визначення наступним чином: змішують один об’єм реактиву 2 з десятьма об’ємами реактиву 1 і 40 об’ємами дистильованої води), перемішують і залишають при кімнатній температурі на 10 хвилин. Після цього додають 0,3 мл реактиву Фоліна-Чекальтеу, перемішують і через 30 хвилин колориметрують при довжині хвилі 750 нм на фотометрі КФК-3. В якості розчину для порівнювання (контролю) використовують 0,6 мл дистильованої води або відповідного буферного розчину, до якого всі реагенти додають у такій же послідовності, як і до досліджуваного розчину. Вміст білка в досліджуваному зразку визначають за калібрувальним графіком.

Побудова калібрувального графіку. Із стандартного розчину альбуміну (2 мг/мл) готують робочі розчини різних концентрацій як показано нижче:

З кожного розчину відбирають по 0,6 мл і додають реактиви у вказаних вище кількостях і послідовності, а потім колориметрують при довжині хвилі 750 нм проти контролю. Виходячи з одержаних даних, будують калібрувальний графік, відкладаючи на осі абсцис відомі концентрації розчину білка (мг/мл), а на осі ординат відповідні значення оптичної густини.