Вопрос 24 Переваривание углеводов в ЖКТ

Вопросы

1. Биологическая роль белков и пептидов. Простые и сложные белки. Первичная, вторичная структуры белка, химические связи их стабилизирующие. Особенности состава и структуры глобулярных и фибриллярных белков (кератин, коллаген, эластин).

2. Третичная и четвертичная структура белка, химические связи их стабилизирующие. Субъединицы и домены. Кооперативное взаимодействие субъединиц, значение для функционирования белков.

3. Нативная конформация белков: функциональное значение, механизм формирования. Денатурация белка. Фолдинг. Шапероны, их роль в фолдинге и ренатурации. Заболевания, связанные с нарушением фолдинга.

4. Физико-химические свойства белков. Белки как гидрофильные соединения. Причины гидрофильности белковых молекул. Факторы, влияющие на заряд и гидратную оболочку белков (значение рН, присутствие электролитов в растворе).

5. Методы разделения и очистки белков. Высаливание, диализ, электрофорез, хроматография. Основные методы количественного определения белка в растворах (фотометрия, иммунохимия).

6. Ферменты. Биологическая роль. Понятие об энзимопатиях и энзимотерапии. Структурно-функциональная организация фермента. Активный центр фермента. Кофакторы и апоферменты. Витаминные и невитаминные коферменты.

7. Различие и сходство неорганических и органических катализаторов. Причины и последствия зависимости активности ферментов от температуры и рН среды. Теории, объясняющие субстратную специфичность ферментов.

8. Механизм ферментативного катализа. Энергия активации, энергетический барьер реакции. Стадии ферментативного катализа. Активность фермента. Единицы измерения активности фермента.

9. Регуляция активности ферментов. Направления, уровни регуляции, биологическое значение. Механизмы регуляции: ковалентная модификация структуры, аллостерическая регуляция.

10. Регуляция активности ферментов. Механизмы конкурентного и неконкурентного ингибирования ферментов. Токсические вещества и лекарственные препараты как ингибиторы ферментов (примеры).

11. Номенклатура и классификация ферментов, связь с типом катализируемой реакции. Понятие об изоферментах, их биологическая роль. Энзимодиагностика.

12. Понятие о биологическом окислении и его значении для организма. Катаболизм энергетических субстратов. Общая схема, локализация, химическая сущность и значение каждого этапа.

13. Ацетил-КоА как центральный метаболит обмена веществ. Пути образования и использования ацетил-КоА. Окислительное декарбоксилирование пирувата.

14. Цикл трикарбоновых кислот: локализация в клетке, химическая сущность, биологическое значение, схема превращений, регуляция.

15. Реакции дегидрирования цикла трикарбоновых кислот: Их биологическое значение, регуляция. Взаимосвязь цикла трикарбоновых кислот с тканевым дыханием.

16. Суммарная реакция цикла трикарбоновых кислот. Пути использования образующихся в цикле метаболитов. Энергетический эффект цикла трикарбоновых кислот.

17. Тканевое дыхание. Локализация, химическая сущность, биологическое значение. Ферменты и реакции тканевого дыхания (дыхательная цепь).

18. Механизм сопряжения окисления и фосфорилирования через протонный градиент. Окислительное фосфорилирование. АТФ-синтаза. Коэффициент окислительного фосфорилирования. Редокс-потенциал субстратов тканевого дыхания и величина коэффициента окислительного фосфорилирования.

19. Свободное окисление. Разобщители дыхания и фосфорилирования. Термогенез.

20. Понятие о свободных радикалах. Активные формы кислорода (супероксид, гидроксильный радикал, оксид азота и перекись водорода), химическая структура, пути образования.

21. Биологическая роль активных форм кислорода. Понятие о физиологическом и патологическом оксидативном стрессе. Механизм повреждающего действия свободных радикалов. Свободно-радикальное окисление.

22. Метаболические и ферментативные антиоксиданты (супероксиддисмутаза, каталаза и глутатионпероксидаза), механизм действия.

Упражнения и задачи

 

1. Напишите формулу пентапептида, содержащего один аминокислотный остаток с гидрофобными радикалами, два - с основными радикалами, по одному - с гидрофильными незаряженным и проявляющим кислотные свойства радикалами.

2. Выберите методы, с помощью которых можно разделить смесь белков: C (молекулярная масса 180 кД, ИЭТ - 4,4), U(молекулярная масса 160 кД, ИЭТ - 6,4) и Z (молекулярная масса 25 кД, ИЭТ - 5,4).

3. Определите направление движения (к аноду или катоду) при электрофорезе ниже перечисленных аминокислот и пептидов при заданном значении рН:

· аспарагиновая кислота (pH 7);

· аспарагиновая кислота (pH 1);

· глутамиласпарагилгистидин (pH 1);

· глутамиласпарагилгистидин (pH 10).

4. При каком значении рН можно разделить с помощью электрофореза три дипептида: аланиллизин, глутамиллейцин, глицилгистидин?

5. Изоэлектрическая точка белков ядра клетки - гистонов, около 10. Преобладание каких функциональных групп боковых радикалов каких аминокислот в гистонах могут обусловливать такую высокую изоэлектрическую точку?

6. У пациента с острым инфарктом миокарда в анализе крови отмечено повышение уровня креатинкиназы. Какой изофермент креатинкиназы будет преимущественно повышен у данного пациента? Из каких субъединиц состоит этот изофермент? Какие еще изоферменты креатинкиназы существуют и в каких тканях в норме они преимущественно локализованы?

7. Сукцинатдегидрогеназа - фермент, катализирующий превращение сукцината в фумарат путем дегидрирования. В экспериментальной системе активность сукцинатдегирогеназы составляла 80 Ед/л. При добавлении в систему малоната активность фермента снизилась до 40 Ед/л. Однако, при последующем добавлении сукцината активность фермента возросла до исходных значений. Объясните с чем это связано?

8. Особенностью кислой фосфатазы из предстательной железы, в отличие от фосфатаз из других тканей, является ингибирование тартрат-ионами. Как можно использовать эти данные для избирательного определения активности кислой фосфатазы предстательной железы в плазме крови?

9. Оптимум действия альфа-амилазы: рН = 6,8, t = 37⁰ С. Как и почему изменится активность фермента при: а) рH = 5,0; б) t = 65⁰ С?

10. Сколько моль АТФ может образоваться при превращении 1 моль пирувата в углекислый газ и воду?

11. Сколько моль АТФ может образоваться при окислении 1 моль ацетил-КоА до углекислого газа и воды?

12. Сколько моль АТФ может образоваться при превращении 1 моль пирувата в ацетил-КоА?

13. Сколько моль АТФ может образоваться при превращении 1 моль сукцината в оксалоацетат?

14. Сколько моль АТФ может образоваться при превращении 1 моль изоцитрата в цикле Кребса в сукцинат в отсутствии и в присутствии разобщителя окисления с фосфорилированием?

15. В суспензию митохондрий добавили 2 ммоль цитрата и 2 ммоль АДФ. Скорость окисления цитрата измеряли по поглощению кислорода. Через некоторое время поглощение кислорода суспензией прекратилось. Почему? Какое вещество нужно добавить, чтобы возобновить потребление кислорода суспензией митохондрий?

16. Пациенты с повышенным уровнем тиреоидных гормонов часто предъявляют жалобы на повышенную температуру тела. Почему?

17. Изменится ли скорость реакций цитратного цикла в присутствии ингибиторов ферментов дыхательной цепи? Если изменится, то как?

18. Какие из коферментов ферментов цикла Кребса связаны с апоферментом нековалентно? В чём биологический смысл данного явления?

19. Почему в норме не может измениться последовательность реакций процесса тканевого дыхания?

20. Вне организма восстановление кислорода водородом происходит в одну реакцию с одномоментным выделением энергии. В чем биологический смысл восстановления кислорода водородом в цепи тканевого дыхания не в одну, а в несколько реакций? В какой форме выделяется и аккумулируется энергия в ходе тканевого дыхания?

 

Вопрос 1.Биологическая роль белков и пептидов. Простые и сложные белки. Первичная, вторичная структуры белка, химические связи их стабилизирующие. Особенности состава и структуры глобулярных и фибриллярных белков (кератин, коллаген, эластин).

БЕЛКИ или ПРОТЕИНЫ - это высокомолекулярные азотсодержащие органические вещества, линейные гетерополимеры, структурным компонентом которых являются аминокислоты, связанные пептидными связями. Пептидом обычно называют олигомер, состоящий не более чем из 50 аминокислот.

Структурообразующие функции. Структурные белки отвечают за поддержание формы и стабильности клеток и тканей (коллаген, гистоны- организация укладки ДНК в хроматине, Транспортные функции(гемоглобин)

Защитные функции.(иммуноглобулин G,который на эритроцитах образует комплекс с мембранными гликолипидами).

Регуляторные функции: белки осуществляют функции сигнальных веществ (гормонов) и гормональных рецепторов(соматотропин,инсулин)

Ферментативные (алкогольдегидрогеназа, глутаминсинтетаза)

Двигательные функции. Взаимодействие актина с миозином ответственно за мышечное сокращение и другие формы биологической подвижности

Запасные функции. В растениях содержатся запасные белки, являющиеся ценными пищевыми веществами. В организмах животных мышечные белки служат резервными питательными веществами, которые мобилизуются при крайней необходимости.

Белки: простые (только из а/к), сложные(состоят из апопротеина - белковой части, и простетической части – металла, органические молекулы с низкой молек. массой)

ПРОСТРАНСТВЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ БЕЛКОВОЙ МОЛЕКУЛЫ

В основе каждого белка лежит полипептидная цепь. Она не просто вытянута в пространстве, а организована в трехмерную структуру. Поэтому существует понятие о 4-х уровнях пространственной организации белка, а именно - первичной, вторичной, третичной и четвертичной структурах белковых молекул.

Первичная структура белка - последовательность аминокислотных фрагментов, прочно (и в течение всего периода существования белка) соединенных пептидными связями. Существует период полужизни белковых молекул - для большинства белков около 2-х недель. Если произошел разрыв хотя бы одной пептидной связи, то образуется уже другой белок.

Вторичная структура - это пространственная организация стержня полипептидной цепи. Существуют 3 главнейших типа вторичной структуры:

1) Альфа-спираль - имеет определенные характеристики: ширину, расстояние между двумя витками спирали. Для белков характерна правозакрученная спираль. В этой спирали на 10 витков приходится 36 аминокислотных остатков. У всех пептидов, уложенных в такую спираль, эта спираль абсолютно одинакова. Фиксируется альфа-спираль с помощью водородных связей между NH-группами одного витка спирали и С=О группами соседнего витка. Эти водородные связи расположены параллельно оси спирали и многократно повторяются, поэтому прочно удерживают спиралеобразную структуру. Более того, удерживают в несколько напряженном состоянии (как сжатую пружину).

Бета-складчатая структура - или структура складчатого листа. Фиксируется также водородными связями между С=О и NH-группами. Фиксирует два участка полипептидной цепи. Эти цепи могут быть параллельны или антипараллельны. Если такие связи образуются в пределах одного пептида, то они всегда антипараллельны, а если между разными полипептидами, то параллельны.

3) Нерегулярная структура - тип вторичной структуры, в котором расположение различных участков полипептидной цепи относительно друг друга не имеет регулярного (постоянного) характера, поэтому нерегулярные структуры могут иметь различную конформацию.

Классификация белков по форме молекул

2 группы: глобулярные и фибриллярные. К глобулярным относятся белки, соотношение продольной и поперечной сторон которых не превышает 1:10, а чаше составляет 1:3 или 1:4, т.е. белковая молекула имеет форму эллипса. Большинство индивидуальных белков человека относят к глобулярным белкам. Они имеют компактную структуру и многие из них за счёт удаления гидрофобных радикалов внутрь молекулы, хорошо растворимы в воде

Фибриллярные белки имеют вытяную структуру, в которой соотношение продольной и поперечной осей составляет более 1:10. К фибриллярным белкам относят коллагены, эластин, кератин, выполняющие в организме человека структурную функцию, а также миозин, участвующий в мышечном сокращении и фибрин — белок свёртывающей системы крови.

Строение и функции коллагенов

Коллагены — семейство родственных фибриллярных белков, секретируемых клетками соединительной ткани. Коллагены — самые рапространенные белки не только межклеточно го матрикса, но и организма в целом, они составляют около 1/4 всех белков организма че­ловека. В межклеточном матриксе молекулы коллагена образуют полимеры, называемые фибриллами коллагена. Фибриллы коллагена обладают огромной прочностью и практически нерастяжимы. Именно поэтому большое количество коллагеновых волокон, состоящих из коллагеновых фибрилл, входит в состав кожи, сухожи­лий, хрящей и костей.

Необычные механические свойства коллаге­нов связаны с их первичной и пространствен­ной структурами. Молекулы коллагена состоят из трёх полипептидных цепей, называемых а-цепями. Коллаген имеет в своём составе 1000 аминокислотных остатков. Первичная структура а-цепей коллагена нео­бычна, так как каждая третья аминокислота в полипептидной цепи представлена глицином, до 1/4 аминокислотных остатков составля­ют пролин или 4-гидроксипролин, около 11% — аланин. В коллагене отсутствуют такие аминокислоты, как цистеин и триптофан, а гистидин, метионин и тирозин находятся лишь в очень небольшом количестве. В составе первичной структуры а-цепи коллагена содержится также необычная аминокислота — гидрокси-лизин. Полипептидную цепь коллагена можно представить как последовательность триплетов Гли-X-Y, где X и Y могут быть любыми ами­нокислотами, но чаще в положении X стоит пролин, а в положении Y — гидроксипролин или гидроксилизин. Каждая из этих аминокис­лот имеет большое значение для формирова­ния коллагеновых фибрилл.

Пролин благодаря своей структуре вызывает изгибы в полипептидной цепи, стабилизируя ле-возакрученную спиральную конформацию.Спираль пептидной цепи коллагена стабилизи­рована не за счёт водородных связей (так как пролин их не образует), а силами стерического отталкивания пирролидиновых колец в остат­ках пролина. В результате расстояние между аминокислотными остатками по оси спирали увеличивается, и она оказывается более развёр­нутой по сравнению с туго закрученной а-спиралью глобулярных белков.

Спирализованные полипептидные цепи, пе­ревиваясь друг около друга, образуют трёхце-почечную правозакрученную суперспиральную молекулу, часто называемую тропоколлагено. Цепи удерживаются друг около дуга за счёт водородных связей, возникающих меж­ду амино- и карбоксильными группами пептид­ного остова разных полипептидных цепей, вхо­дящих в состав трёхспиральной молекулы. «Жёсткие» аминокислоты — пролин и гидро­ксипролин — ограничивают вращение полипеп­тидного стержня и увеличивают тем самым ста­бильность тройной спирали.

Глицин, имеющий вместо радикала атом водорода, всегда находится в месте пересечения цепей-отсутствие радика­ла позволяет цепям плотно прилегать друг к другу.

В результате такого скручивания пептидных остовов полипептидных цепей и наличия удли­нённой структуры два других радикала из триа­ды аминокислот Гли-X-Y оказываются на на­ружной поверхности молекулы тропоколлагена. Некоторые комплементарные участки молекул тропоколлагена могут объединяться друг с дру­гом, формируя коллагеновые фибриллы, причём эти участки расположены таким образом, что одна нить тропоколлагена сдвинута по отноше­нию к другой примерно на 1/4 (рис. 1-42). Меж­ду радикалами аминокислот возникают ионные, водородные и гидрофобные связи. Важную роль в формировании коллагеновых фибрилл играют модифицированные аминокис­лоты:

гидроксипролин и гидроксилизин. Гидроксильные группы гидроксипролина соседних цепей тропоколлагена образуют водородные связи, укрепляющие структуру коллагеновых фибрилл. Радикалы лизина и гидроксилизина необходимы для образования прочных попереч­ных сшивок между молекулами тропоколлагена, ещё сильнее укрепляющие структуру коллагеновых фибрилл. Кроме того, к гидроксильной группе гидроксилизина могут присоединяться углеводные остатки (гликозилирование колла­гена), функция которых пока неясна.

Таким образом, аминокислотная последова­тельность полипептидных цепей коллагена по­зволяет сформировать уникальную по своим механическим свойствам структуру, обладающую огромной прочностью. Изменение в первичной структуре коллагена может приводить к разви­тию наследственных болезней.

2. Строение и функция эластина

В отличие от коллагена, образующего проч­ные фибриллы, способные выдержать большие нагрузки, эластин (также белок межклеточного матрикса) обладает резиноподобными свойства­ми. Нити эластина, содержащиеся в тканях лёг­ких, в стенках сосудов, в эластичных связках, могут быть растянуты в несколько раз по срав­нению с их обычной длиной, но после снятия нагрузки они возвращаются к свёрнутой конформации.

Эластин содержит в составе около 800 амино­кислотных остатков, среди которых преоблада­ют аминокислоты cнеполярными радикалами, такие как глицин, ватин, аланин. Эластин со­держит довольно много пролина и лизина, но лишь немного гидроксипролина; полностью от-сутствует гидроксилизин.

Наличие большого количества гидрофобных радикалов препятствует созданию стабильной глобулы, в результате полипептидные цепи эла­стина не формируют регулярные вторичную и третичную структуры, а принимают в межкле­точном матриксе разные конформации с при­мерно равной свободной энергией (рис. 1-43). Это как раз тот случай строения первичной структуры, когда отсутствие одной стабильной упорядоченной конформации приводит к воз­никновению необходимых белку свойств.

2. Строение и функция эластина

В отличие от коллагена, образующего проч­ные фибриллы, способные выдержать большие нагрузки, эластин (также белок межклеточного матрикса) обладает резиноподобными свойства­ми. Нити эластина, содержащиеся в тканях лёг­ких, в стенках сосудов, в эластичных связках, могут быть растянуты в несколько раз по срав­нению с их обычной длиной, но после снятия нагрузки они возвращаются к свёрнутой кон-формапии.

Эластин содержит в составе около 800 амино­кислотных остатков, среди которых преоблада­ют аминокислоты cнеполярными радикалами, такие как глицин, ватин, аланин. Эластин со­держит довольно много пролина и лизина, но лишь немного гидроксипролина; полностью от-сутствует гидроксилизин.

Наличие большого количества гидрофобных радикалов препятствует созданию стабильной глобулы, в результате полипептидные цепи эла­стина не формируют регулярные вторичную и третичную структуры, а принимают в межкле­точном матриксе разные конформации с при­мерно равной свободной энергией (рис. 1-43). Это как раз тот случай строения первичной структуры, когда отсутствие одной стабильной упорядоченной конформации приводит к воз­никновению необходимых белку свойств.

Более подробно особенности строения и фун­кционирования эластина рассмотрены в разде­ле 15.

2. Третичная и четвертичная структура белка, химические связи их стабилизирующие. Субъединицы и домены. Кооперативное взаимодействие субъединиц, значение для функционирования белков.

ТРЕТИЧНАЯ СТРУКТУРА

Это трехмерная архитектура полипептидной цепи – особое взаимное расположение в пространстве спиралеобразных, складчатых и нерегулярных участков полипептидной цепи. У разных белков третичной структуры различна. В формировании третичной структуры участвуют дисульфидные связи и все слабые типы связей.

Выделяют два общих типа третичной структуры:

1) В фибриллярных белках (например, коллаген, эластин) молекулы которых имеют вытянутую форму и обычно формируют волокнистые структуры тканей, третичная структура представлена либо тройной альфа-спиралью (например, в коллагене), либо бета-складчатыми структурами.

2) В глобулярных белках, молекулы которых имеют форму шара или эллипса (латинское название: GLOBULA - шар), встречается сочетание всех трех типов структур: всегда есть нерегулярные участки, есть бета-складчатые структуры и альфа-спирали.

Обычно в глобулярных белках гидрофобные участки молекулы находятся в глубине молекулы. Соединяясь между собой, гидрофобные радикалы образуют гидрофобные кластеры (центры). Формирование гидрофобного кластера вынуждает молекулу соответствующим образом изгибаться в пространстве. Обычно в молекуле глобулярного белка бывает несколько гидрофобных кластеров в глубине молекулы. Это является проявлением двойственности свойств белковой молекулы: на поверхности молекулы - гидрофильные группировки, поэтому молекула в целом - гидрофильная, а в глубине молекулы - спрятаны гидрофобные радикалы.

ЧЕТВЕРТИЧНАЯ СТРУКТУРА

Встречается не у всех белков, а только у тех, которые состоят из двух или более полипептидных цепей. Каждая такая цепь называется СУБЪЕДИНИЦЕЙ данной молекулы (или ПРОТОМЕРОМ). Поэтому белки, обладающие четвертичной структурой, называют ОЛИГОМЕРНЫМИ белками. В состав белковой молекулы могут входить одинаковые или разные субъединицы. Например, молекула гемоглобина «А» состоит из двух субъединиц одного типа и двух субъединиц другого типа, то есть является тетрамером. Фиксируются четвертичные структуры белков всеми типами слабых связей, а иногда еще и дисульфидными связями.

Четвертичная структура встречается не у всех белков. Каждая полипептидная цепь называется СУБЪЕДИНИЦЕЙ данной молекулы (или ПРОТОМЕРОМ).

Поэтому белки, обладающие четвертичной структурой, называют ОЛИГОМЕРНЫМИ белками.

В состав белковой молекулы могут входить одинаковые или разные субъединицы

Кооперативное взаимодействие

Присвязывание лиганда со специфическим участком белка, происходит изменение в структуре белковой молекуле, которое в свою очередь влияет на активность другого, пространственно удаленного участка (субъединицы, домена).

Кооперативные изменения

конформации олигомерных белков составляют основу механизма регуляции функциональной активности не только гемоглобина, но и многих других белков.

Белок может изменять свою конформацию не только при взаимодействии с лигандом, но и в результате любого химического взаимодействия. Примером такого взаимодействия может служить присоединение остатка фосфорной кислоты (фосфорилирование).

3. Нативная конформация белков: функциональное значение, механизм формирования. Денатурация белка. Фолдинг. Шапероны их роль в фолдинге и ренатурации. Заболевания, связанные с нарушением фолдинга.

НАТИВНОСТЬ (Natura (лат.) – природа) - это уникальный комплекс физических, физико-химических, химических и биологических свойств белковой молекулы, который принадлежит ей, когда молекула белка находится в естественном, природном (нативном) состоянии.

Для обозначения процесса, при котором нативные свойства белка теряются, используют термин ДЕНАТУРАЦИЯ

ДЕНАТУРАЦИЯ - это лишение белка его природных, нативных свойств, сопровождающееся разрушением четвертичной (если она была), третичной, а иногда и вторичной структуры белковой молекулы, которое возникает при разрушении дисульфидных и слабых типов связей, участвующих в образовании этих структур.

Первичная структура при этом сохраняется, потому что она сформирована прочными ковалентными связями.

Разрушение первичной структуры может произойти только в результате гидролиза белковой молекулы длительным кипячением в растворе кислоты или щелочи.

ФАКТОРЫ, ВЫЗЫВАЮЩИЕ ДЕНАТУРАЦИЮ БЕЛКОВ

можно разделить на физические и химические.

Физические факторы

Высокие температуры

Ультрафиолетовое облучение

Рентгеновское и радиоактивное облучение

Ультразвук

Механическое воздействие (например, вибрация).

Химические факторы

Концентрированные кислоты и щелочи. Например, трихлоруксусная кислота (органическая), азотная кислота (неорганическая).

Соли тяжелых металлов

Органические растворители (этиловый спирт, ацетон)

Растительные алкалоиды

Другие вещества, способные нарушать слабые типы связей в молекулах белков.

Воздействие факторами денатурации применяют для стерилизации оборудования и инструментов, а также как антисептики.

Обратимость денатурации

invitro чаще всего денатурация необратима

Invivo, в организме, возможна быстрая ренатурация. Это связано с выработкой в живом организме специфических белков, которые «узнают» структуру денатурированного белка, присоединяются к нему с помощью слабых типов связи и создают оптимальные условия для ренатурации.

Такие специфические белки известны как «белки теплового шока», «белки стресса» или шапероны.

При различных видах стресса происходит индукция синтеза таких белков:

при перегреве организма (40-440С),

при вирусных заболеваниях,

при отравлениях солями тяжелых металлов, этанолом и др. Обратимость денатурации

В пробирке (in vitro) чаще всего это – необратимый процесс. Если же денатурированный белок поместить в условия, близкие к нативным, то он может ренатурировать, но очень медленно, и такое явление характерно не для всех белков.

In vivo, в организме, возможна быстрая ренатурация. Это связано с выработкой в живом организме специфических белков, которые «узнают» структуру денатурированного белка, присоединяются к нему с помощью слабых типов связи и создают оптимальные условия для ренатурации. Такие специфические белки известны как «белки теплового шока» или «белки стресса».

 

Белки стресса

Существует несколько семейств этих белков, они отличаются по молекулярной массе.

Например, известен белок hsp 70 – heatshock protein массой 70 kDa.

Такие белки есть во всех клетках организма. Они выполняют также функцию траспорта полипептидных цепей через биологические мембраны и участвуют в формировании третичной и четвертичной структур белковых молекул. Перечисленные функции белков стресса называются шаперонными. При различных видах стресса происходит индукция синтеза таких белков: при перегреве организма (40-44⁰С), при вирусных заболеваниях, отравлениях солями тяжелых металлов, этанолом и др.

В организме южных народов установлено повышенное содержание белков стресса, по сравнению с северной расой.

Молекула белка теплового шока состоит из двух компактных глобул, соединенных свободной цепью:

Разные белки теплового шока имеют общий план построения. Все они содержат контактные домены.

Разные белки с различными функциями могут содержать одинаковые домены. Например, различные кальций-связывающие белки имеют одинаковый для всех них домен, отвечающий за связывание Ca⁺².

Роль доменной структуры заключается в том, что она предоставляет белку большие возможности для выполнения своей функции благодаря перемещениям одного домена по отношению к другому. Участки соединения двух доменов – самое слабое в структурном отношении место в молекуле таких белков. Именно здесь чаще всего происходит гидролиз связей, и белок разрушается.

 

Молекула белка теплового шока состоит из двух компактных глобул, соединенных свободной цепью.

Также при участии шаперонов происходит фолдинг белков при их синтезе, обеспечивая возможность принять белку нативную структуру.

Болезни, связанные с нарушение фолдинга белков.

Амилоидозы - отложение амилоида в тканях.

Амилоид – фибрилярные отложения плохорастворимых в воде белков (нарушение конформации).

Понятие о прионах

Белки, обладающие инфекционными свойствами (либо попадают в организм, либо образуются спонтанно)

В организме человека существует нормальный аналог этого белка (первичная структура идентична)

Происходит нарушение вторичной структуры

Прионы устойчивы к действию протеаз

Прионы образуют агрегаты, к которым присоединяются нормальные белки, в последствии у которых меняется вторичная структура

Предположительно таким образом развиваются такие заболевания, как куру и коровье бешенство

 

 

4. Физико-химические свойства белков. Белки как гидрофильные соединения. Причины гидрофильности белковых молекул. Факторы, влияющие на заряд и гидратную оболочку белков (значение рН, присутствие электролитов в растворе).

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ. РАСТВОРИМОСТЬ БЕЛКОВ В ВОДЕ.

Большинство белков гидрофильны. Однако белковые молекулы имеют очень большие размеры, поэтому белки не могут образовывать истинных растворов, а только коллоидные. Внешнее проявление этого - это эффект Тиндаля (или конус Тиндаля). Эффект Тиндаля вызывается рассеянием тонкого пучка света при прохождении через белковый раствор. Несмотря на большую величину, многие белковые молекулы не осаждаются в водных растворах. Осаждению белковых молекул препятствуют факторы стабилизации белкового раствора.

ФАКТОРЫ СТАБИЛИЗАЦИИ БЕЛКА В РАСТВОРЕ.

ГИДРАТНАЯ ОБОЛОЧКА - это слой молекул воды, определенным образом ориентированных на поверхности белковой молекулы. Поверхность большинства белковых молекул заряжена отрицательно, и диполи молекул воды притягиваются к ней своими положительно заряженными полюсами (смотрите рисунок).

Чем больше гидрофильных свойств у белковой молекулы, чем больше в ее составе и на ее поверхности аминокислот с полярными (гидрофильными) радикалами, тем сильнее выражена и прочнее удерживается гидратная оболочка и тем больше в ней слоев. Вода гидратной оболочки обладает особыми свойствами: она не является свободной, а связана с белковой молекулой. Это - “связанная” вода. Она принадлежит белку, и поэтому имеет особые свойства.

Свойства воды гидратной оболочки

а) Температура кипения выше 100⁰С.

б) Температура замерзания ниже 0^ОС.

в) В воде гидратной оболочки не растворяются различные соли и другие гидрофильные вещества.

г) Окружая каждую молекулу белка, гидратная оболочка не дает этим белковым молекулам сблизиться, соединиться и выпасть в осадок.

2) ЗАРЯД БЕЛКОВОЙ МОЛЕКУЛЫ. Поверхность большинства белковых молекул заряжена потому, что в каждой молекуле белка есть свободные заряженные СОО^- и NH₃⁺ группы. Изоэлектрическая точка (ИЭТ) большинства белков организма находится в слабокислой среде. Это означает, что у таких белков количество кислотных (СООН) групп больше количества основных групп (NH₃).рН плазмы крови около 7,36 - это выше ИЭТ большинства белков, поэтому в плазме крови белки имеют отрицательный заряд.

молекулы, соотношению полярных и неполяр­ных групп на поверхности нативной молекулы белка, растворимости белков, а также степени устойчивости к воздействию денатурирующих агентов.

/. Различия белков по форме молекул

Как уже говорилось выше, по форме молекул белки делят на глобулярные и фибриллярные. Глобулярные белки имеют более компактную структуру, их гидрофобные радикалы в большин­стве своём спрятаны в гидрофобное ядро, и они значительно лучше растворимы в жидкостях орга­низма, чем фибриллярные белки (исключение составляют мембранные белки).

2. Различия белков по молекулярной массе

Белки — высокомолекулярные соединения, но могут сильно отличаться по молекулярной мас­се, которая колеблется от 6000 до 1 000 000 Д и выше. Молекулярная масса белка зависит от ко­личества аминокислотных остатков в полипеп­тидной цепи, а для олигомерных белков — и от количества входящих в него протомеров (или субъединиц).

3. Суммарный заряд белков

Белки имеют в своём составе радикалы лизи­на, аргинина, гистидина, глутаминовой и аспа-рагиновой кислот, содержащие функциональные группы, способные к ионизации (ионогенные группы). Кроме того, на N- и С-концах поли­пептидных цепей имеются ос-амино- и а-карбок-сильная группы, также способные к ионизации. Суммарный заряд белковой молекулы зависит от соотношения ионизированных анионных ради­калов Глу и Асп и катионных радикалов Лиз, Apr и Гис.

Степень ионизации функциональных групп этих радикалов зависит от рН среды. При рН раствора около 7 все ионогенные группы белка находятся в ионизированном состоянии. В кис­лой среде увеличение концентрации протонов (Н*) приводит к подавлению диссоциации кар­боксильных групп и уменьшению отрицатель­ного заряда белков: -СОО- + Н* -> -СООН. В щелочной среде связывание избытка ОН" с протонами, образующимися при диссоциации NH₃* с образованием вод ы, приводит к умень­шению положительного заряда белков: -NH/+OH-->-NH₂ + Н₂0.

Значение рН, при котором белок приобре тает суммарный нулевой заряд, называют "изо электрическая точка» и обозначают как pН изоэлектрической точке количество положи тельно и отрицательно заряженных групп белка ка одинаково, т.е. белок находится в изоэло! рическом состоянии.

Так как большинство белков в клетке и«ет в своем составе больше анионогенных гр«(-СОО~), то изоэлектрическая точка этих ба ков лежит в слабокислой среде. Изоэлектри ческая точка белков, в составе которых пш обладают катионогенные группы, находит! в щелочной среде. Наиболее яркий пример в ких внутриклеточных белков, содержашЛ мною аргинина и лизина. — гистоны, вход» шие в состав хроматина.

Белки, имеющие суммарный положится ный или отрицательный заряд, лучше растви римы, чем белки, находящиеся в изоэлектри ческой точке. Суммарный заряд увеличивая количество диполей воды, способных связи ваться с белковой молекулой, и препятств>в контакту одноимённо заряженных молекул. I результате растворимость белков увеличив» ется. Заряженные белки могут двигаться ■ электрическом поле: анионные белки, имею! щие отрицательный заряд, будут двигаться ■ положительно заряженному аноду (+), а ка-тионные белки — к отрицательно заряженно­му катоду (—). Белки, находящиеся в изоэлек-трическом состоянии, не перемещаются I электрическом поле.

4. Соотношение полярных и неполярных групп на поверхности нашивных молекул белков

На поверхности большинства внутриклеточ­ных белков преобладают полярные радикалы.) однако соотношение полярных и неполярных групп отлично для разных индивидуальных бел­ков. Так, протомеры олигомерных белков в об­ласти контактов друг с другом часто содержат гидрофобные радикалы. Поверхности белков, функционирующих в составе мембран или при­крепляющиеся к ним в процессе функциони­рования, также обогащены гидрофобными ра­дикалами. Такие белки лучше растворимы в липидах, чем в воде.

 

Вопрос 5.Методы разделения и очистки белков. Высаливание, диализ, электрофорез, хроматография. Основные методы количественного определения белка в растворах (фотометрия, иммунохимия).

Методы выделения и очистки белков

Получение индивидуальных белков из биосинческого материала (тканей, органов, кле-точных культур) требует проведения последовательных операций, включающих:

• дробление биологического материала и раз­рушение клеточных мембран;

• фракционирование органелл, содержащих те или иные белки;

(■ экстракцию белков (перевод их в раство­рённое состояние);

• разделение смеси белков на индивидуаль­ные белки.

Методы разрушения тканей ж экстракции белков

Для разрушения биологического материала используют методы: гомогенизации ткани, ме-год попеременного замораживания и оттаива­ния, а также обработку клеток ультразвуком.

Гомогенизация биологического материала

Ткань, находящуюся в буферном растворе с оп­ределённым значением рН и концентрацией со­лей, помещают в стеклянный сосуд (гомогениза­тор) с пестиком. Вращающийся пестик измельчает я растирает ткань о притёртые стенки сосуда.

Метод замораживания и оттаивания ткани

В результате попеременного замораживания и оттаивания образующиеся кристаллы льда разрушают оболочки клеток.

После разрушения ткани нерастворимые ча­сти осаждают центрифугированием. Последую­щее центрифугирование гомогената с разной скоростью позволяет получить отдельные фрак­ции, содержащие клеточные ядра, митохондрии и другие органеллы, а также надосадочную жид­кость, в которой находятся растворимые белки цитозоля клетки. Искомый белок будет содер­жаться в одной из этих фракций.

Экстракция белков, связанных с мембранами, и разрушение олигомерных белков на прото-меры

Если искомый белок прочно связан с каки­ми-либо структурами клетки, его необходимо перевести в раствор. Так, для разрушения гид­рофобных взаимодействий между белками и липидами мембран в раствор добавляют детер­генты; чаще всего используют тритон Х-100 или додецилсульфат натрия.

Механизм действия детергентов описан в раз­деле «Денатурация белков» (см. рис. 1-15). При действии детергентов обычно разрушаются и гидрофобные взаимодействия между протоме-рами в олигомерных белках.

Удаление из раствора небелковых веществ

Нуклеиновые кислоты, липиды и другие не­белковые вещества можно удалить из раствора, используя их особенные физико-химические свойства. Так, липиды легко удаляются из ра­створа добавлением органических растворите­лей, например ацетона. Однако воздействие должно быть кратковременным, так как ацетон вызывает денатурацию некоторых белков. Нук­леиновые кислоты осаждают добавлением в ра­створ стрептомицина.

2. Методы очистки белков

Наиболее трудоёмкий этап получения инди­видуальных белков — их очистка от других бел­ков, находящихся в растворе, полученном из данной ткани. Часто изучаемый белок присут­ствует в небольших количествах, составляющих доли процента от всех белков раствора.

Так как белки обладают конформационной лабильностью, при работе с белками следует избегать денатурирующих воздействий, поэто­му выделение и очистка белков происходят при низких температурах. На первых стадиях очистки белков целесо­образно использовать методы, учитывающие какую-либо характерную особенность данного белка, например термостабильность или устой­чивость в кислых растворах. Первыми метода­ми очистки необходимо удалить из раствора основную массу балластных белков, которые значительно отличаются от выделяемого белка физико-химическими свойствами. Впоследствии применяют всё более тонкие методы очистки белка.

Очистка белков избирательной денатурацией

Большинство белков денатурирует и выпа­дает в осадок уже при кратковременном на­гревании раствора до 50-70 "С или подкисле-нии раствора до рН 5. Если выделяемый белок выдерживает эти условия, то с помощью из­бирательной денатурации можно удалить боль­шую часть посторонних белков, отфильтровав выпавшие в осадок белки, или осадить их цен­трифугированием.

'•' Высаливание

Метод очистки белков, основанный на раз­личиях в их растворимости при разной концен­трации соли в растворе. Соли щелочных и щё-лочно-земельных металлов вызывают обратимое осаждение белков, т.е. после их удаления белки вновь приобретают способность растворяться, сохраняя при этом свои нативные свойства.

Чаще всего для разделения белков методом высаливания используют разные концентрации солей сульфата аммония — (NH₄)₂S0₄. Чем выше растворимость белка, тем большая концентра­ция соли необходима дляего высаливания.

Гель-фильтрация, или метод молекулярных сит

Для разделения белков часто используют хро-матографические методы, основанные на рас­пределении веществ между двумя фазами, одна из которых подвижная, а другая неподвижная. В основу хроматографических методов положе­ны разные принципы: гель-фильтрации, ион­ного обмена, адсорбции, биологического срод­ства.

Метод разделения белков с помощью гель-фильтрационной хроматографии основан на том, что вещества, отличающиеся молекуляр­ной массой, по-разному распределяются между неподвижной и подвижной фазами. Хром. колонка заполняется гранула пористого вещества.В стрктуре полисахарида образуются полур. связи и формируются гранулы через которые легко проходят вода и низкомолекулярные вещества. В зависимости от условий можно формировать гранулы с разной величиной «пор».Неподвижная фаза — жидкость внутри гранул, в которую способны проникать низкомолекулярные вещества и белки с небольшой молекулярной массой. Смесь белков, нанесения А на хроматографическую колонку, вымывая (элюируют), пропуская через колонку растворитель. Вместе с фронтом растворителя движутся и самые крупные молекулы.

Более мелкие молекулы диффундируют внутри гранул и на некоторое время попадают в неподвижную фазу, в результате чего движение задерживается. Величина пор опрелЯ ляет размер молекул, способных проникали внутрь гранул

Так как гелевая структура сефадекса легко лея формируется под давлением, гели стали заменять более жёсткими матрицами (сефактил, той-1 оперл), представляющими сферические грануян с разными размерами пор. Выбор размеров пор! в гранулах зависит от целей хроматографии (о других хроматографических методах будет ска­зано ниже).

Ультрацентрифугирование

Метод разделения также основан на разли­чии в молекулярных массах белков. Скорость седиментации веществ в процессе вращения в ультрацентрифуге, где центробежное ускорение достигает 100 000-500 000 g, пропорционально их молекулярной массе. На поверхность буфер­ного раствора, помещённого в кювету, наносят тонкий слой смеси белков. Кювету помешают в ротор ультрацентрифуги. При вращении рото­ра в течение 10-12 ч более крупные молекулы (с большей молекулярной массой) оседают в буферном растворе с большей скоростью. В ре­зультате в кювете происходит расслоение смеси белков на отдельные фракции с разной молеку­лярной массой (рис. 1-56). После расслоения белковых фракций дно кюветы прокалывают I иглой и по каплям собирают содержимое не- ' большими порциями в пробирки. 'Электрофорез белков

Метод основан на том, что при определен­иями -значении рН и ионной силы раствора бел-

ки двигаются в электрическом поле со скорос­тью, пропорциональной их суммарному заряду. Белки, имеющие суммарный отрицательный заряд, двигаются к аноду (+), а положительно заряженные белки — к катоду (—).

Электрофорез проводят на различных носи­телях: бумаге, крахмальном геле, полиакрила-мидном геле и др. В отличие от электрофореза на бумаге, где скорость движения белков про­порциональна только их суммарному заряду, в полиакриламидном геле скорость движения белков пропорциональна их молекулярным массам.

Разрешающая способность электрофореза в по­лиакриламидном геле выше, чем на бумаге. Так, при электрофорезе белков сыворотки крови че­ловека на бумаге обнаруживают только 5 главных фракций: альбумины, а,-глобулины, с^-глобули-ны, Р-глобулины и у-глобулины.Элек­трофорез тех же белков в полиакриламидном геле позволяет получить до 18 различных фракций. Для обнаружения белковых фракций полоски бумаги или столбики геля обрабатывают красителем (чаще всего бромфеноловым синим или амидовым чёр­ным). Окрашенный комплекс белков с красите­лем выявляет расположение различных фракций на носителе.

- Ионообменная хроматография

Так же как и электрофорез, метод основан на разделении белков, различающихся суммар­ным зарядом при определённых значениях рН и ионной силы раствора. При пропускании ра­створа белков через хроматографическую колон­ку, заполненную твёрдым пористым заряжен­ным материалом, часть белков задерживается на нём в результате электростатических взаи­модействий.

В качестве неподвижной фазы используют ионообменники — полимерные органические вещества, содержащие заряженные функцио­нальные группы.

Различают положительно заряженные анио-нообменники, среди которых наиболее часто используют диэтиламиноэтилцеллюлозу (ДЭАЭ-целлюлозу), содержащую катионные группы, и отрицательно заряженные катионообменники, например карбоксиметилцеллюлозу (КМ-цел-люлозу), содержащую анионные группы.

+,сн₂-сн₃

-0-CH₂-CH₂-N₄ "0-СН₂-СОО"

НСН₂-СН₃

ДиэтиламинэтилцеллюлозаКарбоксиметилцеллюлоза

Выбор ионообменника опреДСЛЯОТОЯ шридом выделяемого белка. Так, дли выделения ОТрИШ

тельно заряженного белка используют анионооб-менник. При пропускании раствора белка через колонку прочность связывания белка с анионо-обменником зависит от количества отрицательно заряженных карбоксильных групп в молекуле. Белки, адсорбированные на анионообменнике. можно смыть (элюировать) буферными раство­рами с различной концентрацией соли, чаще всего NaCI, и разными значениями рН. Ионы хлора связываются с положительно заряженными фун­кциональными группами анионообменника и I вытесняют карбоксильные группы белков. При низких концентрациях соли элюируются белки, слабо связанные с анионообменником. Постелен- I ное увеличение концентрации соли или измене­ние рН, что меняет заряд белковой молекулы, при водит к выделению белковых фракций, в одной из которых находится искомый белок. \/ Аффинная хроматография, или хроматография по сродству

Это наиболее специфичный метод выделения индивидуальных белков, основанный на изби­рательном взаимодействии белков с лигандами, прикреплёнными (иммобилизированными) к твёрдому носителю. В качестве лиганда может быть использован субстрат или кофермент, если выделяют какой-либо фермент, антигены для выделения антител и т.д. Через колонку, запол­ненную иммобилизованным лигандом, пропус­кают раствор, содержащий смесь белков. К ли-ганду присоединяется только белок, специфично взаимодействующий с ним; все остальные бел­ки выходят с элюатом (рис. 1-58). Белок, ад­сорбированный на колонке, можно снять, про­мыв её раствором с изменённым значением рН или изменённой ионной силой. В некоторых случаях используют раствор детергента, разры­вающий гидрофобные связи между белком и лигандом.

Аффинная хроматография отличается высо­кой избирательностью и помогает очистить вы­деляемый белок в тысячи раз.

 

вопрос 6. биологическая роль ферментов.

ускоряет реакции в клетках,ферменты катализируют 2тыс-3тыс реакций обмена,есть так же вовлеченные в передачу сигнала,процессе дыхания,мышечного сокращения,свертываемость крови,транспорт веществ,обезвреживание токсичных и чужеродных

соединений,нейротрансмиссия.

структурно-функциональная организация.активный центр фермента,его участки

фермент-органическое соединение белковой природы,выполняющая роль катализатора.

активный центр-участок,расположенный в узком гидрофобном углублении поверхности молекулы фермента,участвующий в катализе,на нем протекают хим.реакции.

участки:1)каталитический2)суьстратсвзывающий-этоучасток,отвечающий за специфический комплимент связывания субстрата и образования комплекса фермент-субстрат.

3)часто входит участок для связывания кофактора

Кофакторы и апоферменты, витоминные и невитоминные коферменты

Кофакторы - низкомолекулярные соединения которые требуются для активации ферментов(котолитически активный комплекс фермент, фермент - кофактор - холофермент)

Апофермент-отделение кофакторов обычно связанных и нековаленнтными связями с белком.

Коферменты - это органические вещества, предшественниками которых были витамины (НАД, НСКоА, Н4 - фалат - непрочно связанных с белком и востанавливают их исходные культуры может катализировать уже другим ферментом)

 

Вопрос 7. Различие и сходство неорганических и органических котализаторов причины зависимости активности ферментов от температуры и рН среды.

Сходство и неорганич и органич кат увеличиваю скорость реакции. Неизменяют состояние равновесия химической реакции. Повышает скорость реакции, понижая энергию активации.

Различие. Орг отличаются от неорганических высокой эфферентностью действия (скор ферментотивной реакции больше в 10 в 6 и 10 в 12 раз чем неферментативных) высокой специфичностью действия(способность выбирать определенный субстрат и катализировать специфические реакцию) мягкими условиями протекания ферментотивных реакций.(температуры 37 С и нормальное отмосферное давление, рН ближе к нейтральной. способность к регуляции)

Субстратная специфичность ферментов. Теории обясняющии специфичность ферментов.

Большенство ферментов высокоспецифичны как в природе так и в превращении субстратов. Спец к субстрату обуслоленна комплементарностью структуры субстрат связывающего центра фермента в структуре.

Специфичность - важное св-во ферментов, определяющая био значимость этих молекул.

Субстратная специфичность это способность каждого фермента взаимодействовать лишь с одним определенными субстратоми. Бывают обсалютная субстратная спец - это активный центр комплементарен только одному в живых организмах МАЛО. Пример: Уреаза катализирует гидролиз мочевины до диоксида углерода и амиака. Групповая субстратная специфичность - большенство ферментов катализируют однотипные реакции с небольшим количеством структурных похожих реакция. Стерео спец. - при наличии у субстратов несколько стерео изомеров фермент проявляет обсолютную специфичность одного из них(стерео спец к дисахарам L-аминокислотам к цис-трансизомеров к альфа и бетта гликозидным свзям)

Вопрос 8. Механизм ферментотивного катализа. Энергия активации, энерг барьеры реакции. Стадии ферментотивного катализа. Активность фермента и единицы измерения активности фермента.

Ферментативная реакция это многостадийный процесс, при этом на первой стадии устонавливается индуцированная комплементарное соответствие между ферментом и субстратом и образуется фермент-субстратный комплекс.

-"ключ -замок"-после взаимодействия субстрата (ключ) с активным центром (замок) происходит химическое превращение субстрата в продукт.

-стадии:

1сближение и ориентация субстрата относительнно активного центра фермента

2 образование фермент -субстратного комлекса в результате индуцированного соответствия

3 деформация субстрата и образ нестобильного комплекса фермент-продукт.(ЕР)

4 распад коплекса ЕР с высвобождением продктов реакции с сек центра фермента и освобождение фермента

Энергетическая активность - дополнительное кол-во кинетической энергии, необходимое молекулам вещества, чтобы они вступили в реакцию.

-Активность фермента определяется по скорости реакции, катализируемого фермента, при стандартных условия измерения(определенный буфер его концентрация, ионная сила и тмпература, рН.) в присутствии насыщающих концентрации субстрата и кофермента.

единицы измерения активности ферментов:

-Условные единицы активности - линейная зависимость скорости ферментотивной реакции от кол-ва фермента.

-1а стандартная единица активности - кол-во фермента, которое катализирует превращение 1мкМоль вещ-ва за 1-у минуту.

- удельная активность равна числу единиц активного фермента в образце, деленому на массу ферм. В этом образце.

- молекулярная активность равна числу единиц активного фер., деленому на кол-во фермента, выраженного в мк Молль.

активность зависит от: концентрации фермента, субстрата, кофактора; темпер, рН, присутствие ингибиторов.

 

9. Регуляция активности ферментов. Направления, уровни регуляции, л ^ ' биологическое значение. Механизмы регуляции: ковалентная ^vмодификация структуры, аллостерическая регуляция.

В. Молекулярные механизмы

ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА

МехаНИЗМЫ фермеЩТИВНОго катализа опре­деляются ролью функциональных групп актив­ного центра фермента в химической реакции превращения субстрата в продукт. Выделяют 2 основных механизма ферментативного катали­за: кислотно-основной катализ и ковалентный катализ.

1. Кислотно-основной катализ

Концепция кислотно-основного катализа объясняет ферментативную активность участи­ем в химической реакции кислотных групп (до­норы протонов) и/или основных групп (акцеп­торы протонов). Кислотно-основной катализ — часто встречающееся явление. Аминокислотные остатки, входящие в состав активного центра, имеют функциональные группы, проявляющие свойства как кислот, так и оснований.

К аминокислотам, участвующим в кислотно-основном катализе, в первую очередь относят Цис, Тир, Сер, Лиз, Глу, Асп и Гис. Радикалы этих аминокислот в протоиированной форме — кислоты (доноры протона), в депротонированной — основания (акцепторы протона). Благо­даря этому свойству функциональных групп активного центра ферменты становятся уникаль­ными биологическими катализаторами, в отли­чие от небиологических катализаторов, способ­ных проявлять либо кислотные, либо основные свойства.

Примером кислотно-основного катализа, Iкотором кофакторами являются ионы Zn²⁺, а ш

качестве кофермента используется молекул* NAD⁺, можно привести фермент алкогольдеги*] рогеназу печени, катализирующую реакции) окисления спирта (рис. 2-13):I

С₂Н₅ОН + NAD* ->CHj-COH + NADH + Н*. I

2. Ковалентный катализ

Ковалентный катализ основан на атаке нук-| леофильных (отрицательно заряженных) или электрофильных (положительно заряженных! групп активного центра фермента молекулами субстрата с формированием ковалентной связи между субстратом и коферментом или функци­ональной группой аминокислотного остатка (как правило, одной) активного центра фермента.

Действие сериновых протеаз, таких как трип­син, химотрипсин и тромбин, — пример меха­низма ковалентного катализа, когда ковалентная связь образуется между субстратом и аминокис­лотным остатком серина активного центра фер­мента. Термин «сериновые протеазы» связан с тем, что аминокислотный остаток серина входит в со­став активного центра всех этих ферментов и уча­ствует непосредственно в катализе. Рассмотрим механизм ковалентного катализа на примере хемомотрипсина, осуществляющего гидролиз пептидных связей при переваривании белков в двенад­цатиперстной кишке (см. раздел 9). Субстратами химотрипсина служат пептиды, содержащие ами­нокислоты с ароматическими и циклическимиаирофобными радикалами (Фен, Тир, Три), что вызывает на участие гидрофобных сил в форми­ровании фермент-субстратного комплекса. Механизм ковалентного катализа химотрипсина рас­смотрен на рис. 2-14.

Радикалы Асп_|02, Гис₅₇ и Сер₁₉₅ участвуют в акте катализа. Вследствие нуклеоофильной атаки пептидной связи субстрата происходит разрыв этой связи с образованием •ковалентно-модифицированного серина — ацил-трипсина?.

 

10. Регуляция активности ферментов. Механизмы конкурентного и неконкурентного ингибирования ферментов. Токсические вещества и лекарственные препараты как ингибиторы ферментов (примеры).

биологическая роль ферментов.

ускоряет реакции в клетках,ферменты катализируют 2тыс-3тыс реакций обмена,есть так же вовлеченные в передачу сигнала,процессе дыхания,мышечного сокращения,свертываемость крови,транспорт веществ,обезвреживание токсичных и чужеродных

соединений,нейротрансмиссия.

структурно-функциональная организация.активный центр фермента,его участки

фермент-органическое соединение белковой природы,выполняющая роль катализатора.

активный центр-участок,расположенный в узком гидрофобном углублении поверхности молекулы фермента,участвующий в катализе,на нем протекают хим.реакции.

участки:1)каталитический2)суьстратсвзывающий-этоучасток,отвечающий за специфический комплимент связывания субстрата и образования комплекса фермент-субстрат.

3)часто входит участок для связывания кофактора

Кофакторы и апоферменты, витоминные и невитоминные коферменты

Кофакторы - низкомолекулярные соединения которые требуются для активации ферментов(котолитически активный комплекс фермент, фермент - кофактор - холофермент)

Апофермент-отделение кофакторов обычно связанных и нековаленнтными связями с белком.

Коферменты - это органические вещества, предшественниками которых были витамины (НАД, НСКоА, Н4 - фалат - непрочно связанных с белком и востанавливают их исходные культуры может катализировать уже другим ферментом)

 

11. Номенклатура и классификация ферментов, связь с типом катализируемой реакции. Понятие об изоферментах, их биологическая роль. Энзимодиагностика.

А. Эшимодиагностика

Энзимодиагностика заключается в постановке диагноза заболевания (или синдрома) на осно­ве определения активности ферментов в био­логических жидкостях человека. Принципы эн-зимодиагностики основаны на следующих позициях:

• при повреждении клеток в крови или дру­гих биологических жидкостях (например, в моче) увеличивается концентрация внутри­клеточных ферментов повреждённых клеток;

• количество высвобождаемого фермента до­статочно для его обнаружения;

• активность ферментов в биологических жид­костях, обнаруживаемых при повреждении клеток, стабильна в течение достаточно дли­тельного времени и отличается от нормаль­ных значений;

• ряд ферментов имеет преимущественную или абсолютную локализацию в определён­ных органах (органоспецифичность);

• существуют различия во внутриклеточной локализации ряда ферментов.

I. Причины, приводящие к увеличению количе­ства ферментов в крови

Ферменты плазмы крови можно разделить на 2 группы. Первая, относительно небольшая группа ферментов активно секретируется в плаз­му крови определёнными органами. Например, печень синтезирует неактивные предшествен­ники ферментов свёртывающей системы кро­ви. Ко второй относят большую группу фермен­тов, высвобождающихся из клеток во время их

• Появление в эволюции различных изоформ ЛДГ обусловлено особенностями окисли­тельного метаболизма тканей. Изоферменты ЛДГ₄ и ЛДГ₅ (М-типы ЛДГ) работают эффективно в анаэробных условиях, ЛДГ, ■ ЛДГ₂ (Н-типы) — в аэробных, когда пируват быстро окисляется до С0₂ и Н₂0, а не восссстанавливается до молочной кислоты.

•При ряде заболеваний исследуют активность ДДГ в плазме крови. В норме активность ДДГ составляет_120^ 520 ЕД/л. П овышение активности наблюдают при острых пораже­ниях сердца, печени, почек, а также при гемолитических анемиях. Однако это указывает на повреждение лишь мной из перечисленных тканей.

• Для постановки диагноза необходимо исследование изоформ ЛДГ в плазме крови.

В ней представлены электрофореграммы плазмы крови здорового человека, больного инфар­ктом миокарда и больного гепатитом. Вы­явление в плазме крови тканеспецифичес-ких изоформ ЛДГ используют в качестве диагностического теста повреждения данной ткани. Изоформы креатинкиназы. Креатинкиназа

(КК) катализирует реакцию образования креатинфосфата: Молекула КК — димер, состоящий из субъеди­ниц двух типов: М (от англ. muscle — мышца) и В (от англ. brain — мозг). Из этих субъединиц обра­зуются 3 изофермента — ВВ, MB, MM. Изофермент ВВ находится преимущественно в головном мозге, ММ — в скелетных мышцах и MB — в сер­дечной мышце. Изоформы КК имеют разную электрофоретическую подвижность.

Активность КК в норме не должна превышать 90 МЕ/л. Определение активности КК в плазме крови имеет диагностическое значение при ин­фаркте миокарда (происходит повышение уровня МВ-изоформы). Количество изоформы ММ мо­жет повышаться при травмах и повреждениях ске­летных мышц. Изоформа ВВ не может проник­нуть через гематоэнцефалический барьер, поэтому в крови практически не определяется даже при инсультах и диагностического значения не имеет.

3. Энзимодиагностика при инфаркте миокарда

Примерно 30% больных инфарктом миокарда имеют атипичную клиническую картину этого заболевания. Поэтому необходимо проводить дополнительные методы исследования для под­тверждения повреждения сердечной мышцы.

При инфаркте миокарда наблюдают досто­верные изменения в крови активности фермен­тов КК, ЛДГ и аспартатаминотрансферазы ACT, которые зависят от времени, прошедшего от начала развития инфаркта и от зоны тканевого повреждения., Обнаружение повышенной активности КК н плазме крови — основной энзимодиагностический критерий инфаркта миокарда. Если у пациента с загрудинными болями не обнаружено изменения в активности КК, диагноз инфаркт I миокарда маловероятен.

Дополнительным подтверждением диагноз;» ин­фаркта миокарда служит обнаружение активнос­тей ферментов ACT и ЛДГ в крови больных,I Динамика изменений этих активностей также представлена на этом рисунке. Активность АС I и норме со с тавляет 5-4 0 МЕ/л. При инфаркте ми­окарда активность ACT и ЛДГ повышается через 4-6 ….

 

Вопрос 12.Понятие о биологическом окислении и его значении для организма.Катаболизм энергитических субстратов.

Биологическое окисление- совокупность окислительных процессов в живом организме, протекающих с обязательным участием кислорода. Синоним- ТКАНЕВОЕ ДЫХАНИЕ. Окисленние одного в-ва невозможно без восстановления другого в-ва.Часть окисл-восст. Процессов относиться к биологическому окислению.

 

Вопрос 13.Ацетил-КоА как центральный метаболит обмена в-в.Его пути образования и использования….

1) Пируват с ТДФ в составе Е1 и подвергается декарбокселированию, значит гидроксиэтил - ТДФ + СО2.

2) Дигидролипоилтрансацицилаза (Е2) катализирует перенос ат Н и ацильной группы от ТДФ на окислительную форму липоилмезиновых групп с обр ацетилтиоэфира липоевой кислоты.

3) КоА+ацетильные производные Е2, Ацетил Коа + липоильный остаток, простетическая группа Е2.

4) Дигидролипоилдегидрогеназа (Е3) катализирует перенос ат. Н от восстановл липольных групп на FAД - простетическую группу фермента Е3.

5) FAДН2 передает Н на NAД с образованиемNaДН.

Вопрос 14 Регуляция ЦТК и его взаимная связь с тк дыханием.

-В большинстве тк, где главная функция общего пути катаболизма обеспечивается кл.энергией, важную роль в регуляции играет дыхательный контроль.

-Увелю скорости утилизации АТФ для совершенно различных типов работы, увеличивает к-цию АДФ, что ускоряет окисление NAДН в ЦПЭ и в итоге повышается скорость реакции катализируемых NАД - зависимой дпегидрогеназой...........

 

15.Реакции дегидрирования цикла трикарбоновых кислот: Их биологическое значение, регуляция. Взаимосвязь цикла трикарбоновых кислот с тканевым дыханием. *

Дегидрирование сукцинита

Образовавшийся на предыдущем этапе сукцинат превращается в фумарат под действием сукцинатдегидрогеназы (см. рис. 6-24). Этот фермент — флавопротеин, молекула которого содержит прочно связанный кофермент FAD.

Сукцинат дегидрогеназа прочно связана с внутренней митохондриальной мембраной. Она состоит из 2 субъединиц, одна из которых свя­зана с FAD. Кроме того, обе субъединицы со­держат железо-серные центры; одна — Fe₂S₂, a другая — Fe₄S₄. В железо-серных центрах ато­мы железа меняют свою валентность, участвуя в транспорте электронов.

Дегидрирование малата

В заключительной стадии цитратного цикла малат дегидрируется с образованием оксалоацетата (см. рис. 6-24). Реакцию катализирует NAD-зависимая малатдегидрогеназа, содержа­щаяся в матриксе митохондрий.

Равновесие малатдегидрогеназной реакции сильно сдвинуто влево. Тем не менее, в интактных клетках эта реакция идёт слева направо потому что продукт реакции, оксалоацетат активно используется в цитратсинтазной реакции.

 

вопрос 17.тканевое дыхание.локализация,химическа сущность,биологическое значение.

тканевое дыхание-окисление органических в-в в организме кислорода с образоваем воды и углекислого газа

-локализация-в митохондриях

-химическая сущность:тканевое дыхание включает:

а)отнятие водорода от субстрата(дегидрирование)

б)многоэтапный процесс переноса электронов на кислород:перенос электронов сопровождается уменьшением свободной энергии,часть этой энергии рассеивается в виде тепла,а около 40% на синтез АТФ.

Дыхательная цепь:

каждое звено специфично в отношении донора и акцептора электронов

-на 1-ом этап