double arrow

Тема 1. Транспорт компонентів середовища в клітині мікроорганізмів

КОНСПЕКТ ЛЕКЦІЙ

З дисципліни «Біохімічні основи мікробного синтезу»

Для студентів напряму 6.051401 «Біотехнологія»

 

Затверджено редакційно-видавничою секцією науково-методичної ради ДДТУ

__________2009 р. протокол №_______

 

Дніпродзержинськ

Розповсюдження і тиражування без офіційного дозволу Дніпродзержинського державного технічного університету заборонено

 

Конспект лекцій з дисципліни „Біохімічні основи мікробного синтезу” для студентів денної та заочної форм навчання напряму 6.051401 „Біотехнологія”/ Укл.: старший викладач Філімоненко Д.В., – Дніпродзержинськ, ДДТУ, 2009. – 200 с.

 

Укладачі: ст. викладач Філімоненко Д.В.

Відповідальний за випуск: к.т.н., доцент Гуляєв В.М.

Рецензент: к.т.н., доцент кафедри БТЕ Авраменко С.Х.

Затверджено на засіданні кафедри

біотехнології та екології,

протокол № 11 від 02.03.2009 р.

 

 

Коротка анотація видання. Конспект лекцій складений з урахуванням робочої програми з дисципліни «Біохімічні основи мікробного синтезу».

 

ЗМІСТ

Вступ  
Тема 1. Транспорт компонентів середовища в клітини мікроорганізмів  
1.1 Функції позаклітинних гідролаз  
1.2 Трансортні білки (пермеази)  
1.3 Фосфоенолпіруват-фосфотрансферазна система  
1.4 Піноцитоз  
1.5 Мембранні іонофори  
Тема 2. Азотмісткі компоненти середовища і їхня асиміляція мікроорганізмами  
2.1 Азотмісткі компоненти середовища  
2.2 Ферментативні механізми асиміляції  
Тема 3. Асиміляція вуглеводів мікроорганізмами  
3.1 Основіні відомості про асиміляцію вуглеводів  
3.2 Гексозомонофосфатний шлях  
3.3. Метаболізм вуглеводів,відмінних від глюкози  
3.4 Цикл трикарбонових кислот  
3.5 Гліоксилатний шлях  
3.6 Регуляція активності ферментів циклу три карбонових кислот  
Тема 4. Асиміляція жирів мікроорганізмами  
4.1 Ферментативний гідроліз жирів  
4.2 Піногасники  
Тема 5. Асиміляція вуглеводнів, етанолу, метанолу і ацетату мікроорганізмами  
5.1 Асиміляція вуглеводнів  
5.2 Включення етанолу і ацетату в обмін речовин  
5.3 Асиміляція метанолу  
Тема 6. Основні принципи регуляції обміну речовин у мікроорганізмів  
6.1 Основні уявлення про механізм регуляції  
6.2 Індукція й репресія синтезу ферментних білків  
Тема 7. Метаболічний фонд мікроорганізмів  
7.1 Амінокислоти фонду  
7.2 Нуклеотиди фонду  

ВСТУП

 

Мікробіологічний синтез виступає сьогодні як найважливіша частина сучасної біотехнології. Практично всі основні досягнення біотехнології отримані прямо або побічно при участі мікроорганізмів або продуктів їх обміну.

Під мікробіологічним синтезом розуміють синтез структурних компонентів мікробних клітин або продуктів їх метаболізму з низькомолекулярних з'єднань. Основні особливості мікробіологічного синтезу полягають у наступному:

1) синтез відбувається ферментними системами самої клітини й відбувається переважно внутрішньоклітинно поза залежністю від локалізації цільового продукту після проведення технологічних операцій по його одержанню;

2) синтез походить із низькомолекулярних попередників, які в ході реакцій синтезу, як правило, повинні бути активовані;

3) синтез є енергозалежним процесом;

4) шляхи синтезу пов'язані з катаболізмом, але можуть істотно відрізнятися від них і здебільшого здійснюються іншими ферментними системами.

Завдання мікробіологічного синтезу полягає в тому, щоб одержати максимум цільового продукту й мінімум інших продуктів. Для досягнення надсинтезу необхідно порушити нормальну регуляцію шляхів метаболізму. Цього можна домогтися за допомогою генетичних методів, зокрема методів генетичної інженерії, або шляхом зміни умов культивування. Звичайно ефекту надсинтезу досягають комбінацією цих методів.

Уявлення, які сформувалися в останні роки про те, що практично будь-який метаболіт виконує функції регуляторів, спричинило істотну зміну поглядів, що панували раніше, на вплив компонентів середовища і їх катаболітів на хід процесу. Взаємозв'язок продуктів обміну речовин у клітині, множинність функції того самого метаболіту в різних фізіологічних умовах, наявність шунтових метаболічних шляхів, обмін коферментами й кофакторами в сполучених ферментативних реакціях і т.п. ускладнюють інтерпретацію й прогноз ходу мікробіологічного синтезу.

Одержання й використання нових мутантних штамів, сконструйованих методом генетичної інженерії, не звільняє від необхідності знати механізми біохімічних реакцій і механізми їх регуляції. Навіть якщо мова буде йти про конструювання зовсім нового генома, то функціонувати повинні відомі ферментні системи, робота яких здійснюється відповідно до основних положень біохімії. І нарешті, якщо відбувається спроба конструювання нового генома, то елементами нової "конструкції", у майбутньому повинні стати нині відомі системи.

Істотною особливістю реакцій біосинтезу є активування низькомолекулярних метаболітів або проміжних продуктів для здійснення чергової ферментативної реакції. Найголовніші з них:

- утворення КоА-ацильних похідних,

- утворення аденилатів,

- фосфорилювання в реакціях з АТФ із наступним розщепленням проміжного продукту фосфатазою.

Відомо, що багато продуктів мікробіологічного синтезу відносять до вторинних метаболітів. Ми не користуємося цим терміном, оскільки сьогодні немає строгого визначення, які продукти відносяться до їх числа. Синтез ферментів й їхнє надходження в зовнішнє середовище підкоряються закономірностям, відмінним від закономірностей, характерних для синтезу низькомолекулярних метаболітів. Для синтезу ферментів застосовні загальні подання про синтез білків. Відомо, що багато ферментів синтезуються у вигляді своїх неактивних попередників, а потім здобувають свою активну конформацію. Здійснення більшості ферментативних реакцій неможливо без коферментів. Їхній дефіцит може привести до гальмування ферментативної реакції, де кофермент виконує функції переносника відповідних функціональних груп у реакції.

Для технологів важливе питання локалізації ферментних білків, тому особлива увага повинне бути приділене механізмам секреції ферментних білків.

Матеріал курсу значною мірою базується на інформації, по органічній і біологічній хімії, генетиці й мікробіології.

Тема 1. Транспорт компонентів середовища в клітині мікроорганізмів

1.1 Функції позаклітинних гідролаз

 

Ензиматичні процеси мікробіологічного синтезу, як відомо, протікають у клітинах. Основними компонентами реакцій синтезу є низькомолекулярні метаболіти. В середовищах, де відбувається культивування, звичайно присутні як високомолекулярні, так і низькомолекулярні органічні сполуки поряд з мінеральними компонентами. Органічні сполуки надходять у клітку, коли мають відносно невеликий розмір молекули. У зв'язку із цим високомолекулярні з'єднання піддаються в середовищі ферментативному гідролізу завдяки активності екзоферментів мікроорганізмів До них у першу чергу відносяться гідролітичні ферменти. Ферменти, що відносяться до гідролаз, найбільш просто організовані, вони не вимагають для прояву активності кофакторів або коферментів. Лише частина з них має потребу в присутності деяких катіонів.

Розщеплення пептидного зв'язку здійснюють протеолітичні ферменти, що відносяться до підкласу пептид-гідролаз. У результаті реакції утворюються амінокислоти або олігопептиди, які здатні проникати в клітину завдяки наявності систем переносу. Залежно від специфічних особливостей обміну речовин культури позаклітинні протеолітичні ферменти активні у широкому інтервалі рН - від 2,5 до 11,0. Гідроліз полісахаридів здійснюють ферменти, що мають загальну назву глікозидази. Вони мають строгу специфічність щодо характеру зв'язку й вуглеводного залишку. З огляду на хімічну природу вуглеводів, що входять до складу середовища в якості її компонентів, найбільше значення мають амілази, які гідролізують полісахариди типу крохмалю; целюлази, якщо серед компонентів присутня клітковина; полігалактуроназа - для пектину й т. п. Кінцевими продуктами, які утворюються в результаті дії названої групи ферментів, є оліго- або моносахариди й уронові кислоти.

Нуклеїнові кислоти розщеплюються завдяки активності позаклітинних нуклеодеполімераз. Відомі неспецифічні до природи вуглеводного компонента нуклеази, що діють на ДНК і РНК, дезоксирибонуклеази, які гідролізують ДНК, і рибонуклеази, які гідролізують РНК. Останні можуть мати специфічність до природи основ, біля яких відбувається розрив фосфодиефірного зв'язку. В мікроорганізмів переважно виявлено гуаніл-специфічні РНКази. Відомі РНКази, що проявляють свою дію в кислому або лужному інтервалі рН. Кінцевими продуктами дії названих ферментів є нуклеотиди. Останні можуть піддаватися подальшій деградації. Відщіплення фосфатної групи відбувається завдяки активності фосфомоноестерази (фосфатази). Нуклеозидази розщеплюють нуклеозиди до основ і вуглеводів.

Жири у вільному виді рідко присутні в середовищі. Виключення становлять виробництва, де їх уводять у середовища як піногасники. Звичайно жири входять до складу необезжирених рослинних продуктів, що вводять до середовища в якості компонентів. Основною групою ферментів, що здійснюють гідроліз жирів, є гідролази, що діють на ефірні зв'язки. Оскільки основну масу жирів становлять тригліцериди жирних кислот, найбільше значення має триацилгліцерол-ліпаза, або просто ліпаза, як її прийнято називати в повсякденному вжитку. У результаті діяльності цього ферменту відбувається гідроліз ефірних зв'язків й утворення гліцерину й жирних кислот.

На відміну від більшості культур дріжджі мають дуже низьку активність позаклітинних гідролаз і, як правило, мають потребу в готових низькомолекулярних компонентах середовища.

 

1.2 Транспортні білки (пермеази)

 

Надходження окремих компонентів середовища в клітину, як правило, не є простим фізико-хімічним актом, що відбувається в результаті різностей концентрацій або дифузії. Здебільшого перенос речовин із середовища в клітину відбувається проти градієнта концентрацій, тобто активний транспорт, що вимагає певних енергетичних витрат і наявності спеціального "переносника". У результаті цього акту в клітині будуть утримуватися речовини, концентрації яких у багато разів вище їхніх концентрацій у зовнішньому середовищі. Переносники мають білкову природу, багато в чому вони подібні з ферментами, зокрема за механізмами фермент-субстратної взаємодії. Функція таких переносників, які називають пермеазами, може бути описана рівнянням Михаеліса - Ментен і т. і.

Синтез пермеаз перебуває під контролем генетичного апарата клітини. Якщо внаслідок мутацій порушується синтез певної пермеази, клітина може втратити здатність використовувати той компонент середовища, за перенос якого відповідає дана пермеаза. Питання про субстратну специфічність пермеаз докладно досліджується. Відомі численні факти конкуренції за переносник між близькими за хімічною природою речовинами. Регуляція активності транспортних систем, подібно регуляції ферментативної активності, може відбуватися шляхом контролю за механізмом зворотного зв'язку. Як й у випадку синтезу ферментних білків, розрізняють конститутивний й індуцибельний механізми. Перший широко розповсюджений у пермеаз амінокислот, другий - у вуглеводів. Деталі механізму переносу і його регуляції в еукаріотів і прокаріотів можуть розрізнятися внаслідок розходжень у будові геному й розходженні хімічного складу й будови клітинної стінки. Істотно важливо, що при активному транспорті не спостерігається хімічної модифікації вихідної речовини.

Схема транспорту за участю переносника в самому загальному її виді показана на рис 1-1.

Рисунок 1.1 - Схема транспорту за участю переносника

А і Б – зовнішня та внутрішня поверхні мембрани, S — субстрат

 

Відповідно до цієї схеми є, по щонайменше чотири етапи при переносі субстрату із зовнішнього середовища в клітину:

1) рецепція, тобто утворення комплексу з активним центром переносника;

2) перенос, або транслокація;

3) дисоціація комплексу зі звільненням субстрату;

4) регенерація транспортної системи.

У цей час деякі транспортні білки отримані в гомогенному стані. Відомі транспортні білки мають молекулярну масу 30-35 тис., хоча є деякі виключення. Більшість із вивчених білків стійкі до температурних впливів, слабо інактивуються етанолом, трохи більш стійкі до кислот, чим до лугів. У їхньому складі не знайдено яких-небудь небілкових кофакторів.

Характерно, що співвідношення полярних і неполярних амінокислот у цих білках аналогічно їхньому співвідношенню в глобулярних білках. Механізм зв'язування білків із субстратом вимагає свого детального аналізу на ізольованих системах. Фізико-хімічні процеси, що відбуваються при акті переносу, піддаються докладному вивченню. Можна припустити існування декількох систем. Одна з них припускає рух переносника в мембрані по типу поплавця, інша - обіг переносника навколо якоїсь умовної осі, третя - переміщення субстрату по переноснику за рахунок його конформаційних змін у процесі транспорту. Можливо, всі вони мають місце в одному організмі, але діють при переносі різних субстратів.

Для транспорту амінокислот існує безліч пермеазних білків. У спрощеному вигляді існує 4 системи транспорту:

1) специфічна система для транспорту нейтральних і ароматичних амінокислот;

2) система для основних амінокислот;

3) система для кислих амінокислот;

4) неспецифічна загальна система транспорту.

Ряд амінокислот має не одну, а декілька пермеаз, у тому числі специфічні та неспецифічні.

Не виключено, що система транспорту амінокислот у мікробні клітини підкоряється механізму регуляції за принципом зворотного зв'язку.

Украй важливим фактором в переносі є фізико-хімічний стан мембран. Компонентом середовища, що може регулювати хімічний склад мембран є біотин.

У ряді випадків нуклеїнові кислоти й білки потрапляють у клітини, безпосередньо проникаючи через клітинну мембрану. Мається на увазі, зокрема, перенесення генетичної інформації, зосередженої в ДНК, у здатні до рецепції бактеріальні клітини. Щоб клітина стала компетентною, на неї повинен бути переведений ендогенний білок, пов'язаний із плазматичною мембраною, що називається активатором або фактором компетентності. Цей фактор має молекулярну масу близько 10000 й є видоспецифічним. На поверхні бактеріальної клітини він зв'язується рецептором, молекулярна маса якого 50000, і, взаємодіючи із ним, "включає" процеси, необхідні для сприйняття трансформуючої ДНК. На цьому підготовчому етапі синтезуються РНК і білок, а також утворюється аглютинін, що, зв'язуючись із цитоплазматичною мембраною, змінює її поверхневі властивості. Досягнувши цитоплазматичної мембрани, ДНК адсорбується на її поверхні подібно вірусній частці. Цей процес необоротний і здійснюється без витрат енергії. Потім відбувається "втягування" ДНК усередину, яке потребує витрат енергії, і далі, якщо ДНК гомологічна, вбудовування її в хромосому бактерії. Аналогічним образом поглинення білків відбувається, мабуть, лише при наявності на поверхні клітинної мембрани специфічного рецептора. Цей рецептор так змінює локальну проникність мембрани, що через неї можуть проходити навіть великі молекули.

Представляється досить імовірним, що при зв'язування макромолекули частина мозаїчної рідинної структури мембрани перетерплює таку деформацію, що молекула одержує можливість проникнути усередину клітини. Ця деформації може бути викликана або локальними фізичними силами (наприклад, поверхневим натягом чи гідрофобною взаємодією у мембрані). Оскільки білок зв’язується з рухливим мембранним рецептором, то процеси переорієнтації й обертання всього комплексу виявляються дуже швидкими.

У бактеріальних культур відома велика розмаїтість транспортних систем, специфічних стосовно різних цукрів. У зв'язку із цим кінетика транспорту при дослідженні на цілих клітинах може бути складною, і не піддаватися закономірностям рівняння Міхаеліса-Ментен. Причина цього явища полягає в тому, що в різних інтервалах концентрацій транспорт може здійснюватися різними системами.

Важко зробити узагальнення стосовно транспорту органічних кислот. Необхідно мати на увазі, що у випадку індуктивної природи синтезу пермеази роль індуктора може виконувати не стільки органічна кислота, уведена як компонент середовища, скільки органічна кислота, яка з'явилася в клітині в результаті метаболізму вуглеводів. Особливо це відноситься до органічних кислот циклу Кребса.

Крім активного транспорту існує так звана полегшена дифузія. При полегшеній дифузії відбувається вирівнювання концентрацій речовини, розташованої поза й усередині клітини. У цьому випадку також бере участь переносник, який переміщується між зовнішньою й внутрішньою поверхнями мембран, зв'язуючи й віддаючи молекулу транспортуємої речовини. Тут не відбувається переносу проти градієнта концентрації. Тому швидкість надходження речовини в клітину є функцією його концентрації в зовнішнім середовищі.

Існує точка зору, що розходження в транспортних системах для тих самих з'єднань у різних організмів обумовлені особливостями еволюційного процесу і їхнім екологічним минулим. Відмічають, наприклад що в дріжджів частіше, ніж у бактерій і грибів, зустрічають полегшену дифузію.

Цей факт зв'язують із тим, що дріжджові культури звичайно поширені на багатих вуглеводами субстратах, бактерії й гриби перебувають в умовах обмеженого живлення, коли необхідний активний транспорт поживних речовин із середовища в клітину для їх збереження в природі.

 

1.3. Фосфоенолпіруват-фосфотрансферазна система

 

У результаті функціонування системи в клітині накопичуються вуглеводи в зміненій молекулярному формі в порівнянні з їхнім станом у середовищі. Процес іде зі споживанням енергії. Активність системи зв'язують із наявністю фосфоенолпірувату, внаслідок чого її називають фосфоенолпіруват-фосфотрансферазною системою. Складається вона з декількох білкових компонентів. У мембрані локалізований фермент ІІ. Його активність зв'язана, принаймні, з наявністю двох білкових фракцій, одна із яких має функцію впізнавання специфічного вуглеводного компонента реакцій. У цитоплазмі перебувають фермент І і білок НРг. Обоє вони відповідальні за реакцію фосфорилювання.

У реакції, яка каталізується ферментом І, цитоплазматичний білок НРr фосфорилюється за рахунок фосфоенолпірувату. Ця реакція незвичайна у двох відношеннях. По-перше, у ній як безпосередній донор фосфатної групи використовується фосфоенолпіруват, тоді як у більшості реакцій фосфорилювання донором служить АТФ. По-друге, молекула білка фосфорилюється по першому атому азоту імідазольного кільця одного із двох залишків гістидину. В іншій реакції бере участь фермент ІІ, що має активний центр, що реагує з білком НРг. Коли вони зв'язуються, утворюється єдиний комплекс, фермент ІІ - вуглевод - фосфорильований НРг. Тут донором фосфатної групи для вуглеводів, що транспортуються, служить фосфорильований білок.

Існує, імовірно, декілька різних за субстратною специфічністю молекулярних форм ферменту ІІ. Крім того, є факти, які дають серйозну підставу думати, що в реакції фосфориляції беруть участь не один, а два специфічних стосовно вуглеводів білка.

З відомих акцепторів фосфатної групи в цій системі варто назвати D-глюкозу, D-галактозу, D-фруктозу, а також деякі пентози, глюкозиди й галактозиди. Ця система може забезпечувати їхній транспорт у клітину. Схематично процес І показаний на рис. 1.2. На рисунку наведена узагальнена модель, запропонована Розенманом, де відведене також місце процесу полегшеної дифузії й активного переносу. На етапі а відбувається взаємодія субстрату із центром зв'язування мембранного ферменту ІІ. У результаті його конформаційної зміни (етап б) вуглевод виявляється на внутрішній стороні цитоплазматичної мембрани. При високих швидкостях дисоціації комплексу надходження вуглеводу в клітину (етап в) здійснюється шляхом полегшеної дифузії. На етапі г відбувається зв'язування білка НРГ ферментом ІІ. У такому стані завдяки активності ферменту І (етап д) здійснюється фосфорилювання імідазольного залишку гістидина білка НРг.

Перенос фосфатної групи з фосфорильованого білка на вуглевод веде до транслокації радикала, у результаті в клітину надходить фосфорильований вуглевод (етап е). Такий механізм переносу часто називають транслокацією. Відповідно до цієї схеми ферменти І й ІІ, НРг-білок виступають як компоненти єдиної пермеазної системи.

 

Рисунок 1.2 – Схема функціонування фосфоенолпіруват-фосфотрансферазної системи

Розглядаючи схему й розуміючи її як наглядне зображення процесу переносу шляхом транслокації, слід зазначити, що перша з названих у тексті реакцій, що відповідає етапу в, відбувається в цитоплазмі, а друга - між фосфорильованим білком і вуглеводом - на мембранній системі (етап е).

Процес переносу вуглеводів неминуче повинен бути зв'язаний зі швидкістю їхнього ферментативного перетворення в клітині, що у свою чергу пов'язане з ростом біомаси. Якщо швидкість надходження вуглеводу в клітину низька, то клітини при цьому не можуть рости з достатньою інтенсивністю. Якщо перенос відбувається дуже швидко, те це приводить до непродуктивної витрати енергії й нагромадженню токсичних для клітини концентрацій фосфорних ефірних вуглеводів. Інтенсивність гліколізу повинна контролювати надходження вуглеводу в бактерії. Функцію контролю надходження вуглеводів у клітину виконують також амінокислоти.

 

1.4 Піноцитоз

 

Механізм транспорту в мікробні клітки за допомогою піноцитозу, очевидно, мало розповсюджений. Звичайно завдяки піноцитозу в клітини надходять досить великі частки. Яким шляхом відбувається крізь зовнішні шари клітинної стінки мікроорганізмів транспорт цих часток, сказати важко. Коли вони досягають цитоплазматичної мембрани, відбувається сорбція прониклої частки, мембрана утворює деяку подобу мішка, зверненого усередину клітини. Потім краї його замикаються, у результаті утворюється піноцитарний пухирець, що відривається від зовнішньої мембрани й мігрує усередину клітини. Тут мембрана пухирця розчиняється, і захоплені клітиною частки виявляються зваженими в цитоплазмі. Немає достатньої ясності про енергетичні процеси, пов'язаних з механізмом піноцитозу. У тих клітинах, які містять лізосоми, можливо, відбувається злиття з ними піноцитарних пухирців, після чого за рахунок активності гідролітичних ферментів мембрана пухирців руйнується.

 

1.5 Мембранні іонофори

 

Відомі специфічні речовини, які здійснюють перенос іонів лужних металів через мембрану. Речовини ці - продукти життєдіяльності мікроорганізмів, однак у нормальних обмінних процесах участі, видимо, не приймають. Але вони становлять інтерес при вивченні функції мембран. Речовини ці одержали назву мембранних іонофорів. По хімічній природі вони відносяться до циклодепсипептидів, сполук, молекули яких складаються з амінокислот і оксикислот. Іонофори мають здатність зв'язувати іони металів у розчинах у результаті погодженої взаємодії з декількома карбонільними групами пептидного кістяка. Іон при цьому втримується в молекулярній площині комплексону за рахунок іон-дипольних зв'язків. До числа мембранних іонофор відносяться, зокрема, антибіотики, валіноміцин, еніатини А, В, С і граміцидин А. За принципом дії іонофори діляться на два основних класи: речовини-переносники й речовини, що утворюють іон-проникливі пори, або "канали".

Валіноміцин являє собою макроциклічний депсипептид, побудований із трьох ідентичних фрагментів, кожний з яких послідовно складається із залишків D-валіну, L-валіну, L-молочної кислоти, D-оксиізовалеріанової кислоти:

 


Понравилась статья? Добавь ее в закладку (CTRL+D) и не забудь поделиться с друзьями:  



Сейчас читают про: