Визначення бактеріальної забрудненості води (колі-титру)

 

Мета роботи: навчитись визначати бактеріальне забруднення води

 

ЗАГАЛЬНI ПОЛОЖЕННЯ

 

Мікроорганізми й передусім бактерії - одна з невід'ємних ланок водних екосистем. Залежно від способу харчування вони поділяються на чотири групи.

Автотрофні бактерії отримують енергію і будують власний організм за рахунок окиснення неорганічних сполук, таких як сульфіди й сполуки феруму Особливо сприятливі для них стічні води гірничо-збагачуваних комбінатів, шахт та ін. Окиснюючи сполуки феруму й сульфуру, ці бактерії істотно понижують рН водного середовища. Висока кислотність води руйнує водні екосистеми, знищуючи багато видів флори й фауни; крім того, така вода агресивна щодо бетону, металів тощо і становить загрозу здоров'ю людей.

Сапрофітні бактерії харчуються мертвою органічною речовиною, розкладаючи тіла відмерлих рослин і тварин до простих сполук (води, вуглекислого газу й мінеральних солей). Без цих організмів життя на Землі стало б неможливим, бо воно швидко перетворилася б на «склад» трупів відмерлих організмів.

Бактерії-коменсали харчуються за рахунок живих істот, не завдаючи шкоди. Таке «співжиття» бактерій і організму-хазяїна взаємокорисне. Наприклад, у товстому кишечнику людини й тварин знаходиться дуже багато коліморфних бактерій. Вони тут мають ідеальні умови середовища: постійну температуру, вологість і їжу; за межами організму-хазяїна вони довго існувати не можуть. Ці бактерії сприяють кращому процесу травлення, розкладаючи деякі компоненти їжі до таких сполук, які організм людини може засвоїти. Без таких бактерій людина й тварини існувати не можуть.

Паразитичні бактерії теж існують за рахунок інших організмів, але завдаючи їм при цьому шкоди. їх ще називають патогенними або хвороботворними, оскільки їх розмноження викликає захворювання організму. Насамперед це зумовлюється продуктами життєдіяльності цих бактерій, так званими токсинами (отрутами), які викликають підвищення температури, розлад важливих життєвих функцій, порушення гомеостазу тощо. Особливо небезпечні бактерії, які є збудниками тифу, холери, дезинтерії й можуть спричинити смерть людини. Тому бактеріальні аналізи - необхідна складова досліджень води джерел, які використовуються для пиття, купання тощо.

Патогенні бактерії потрапляють у воду головним чином із неочищених чи погано очищених комунальних стоків, сміттєзвалищ, вигрібних ям тощо. Методи виявлення бактерій досить трудомісткі й дорогі, вони ґрунтуються на складних біохімічних аналізах й доступні лише спеціалізованим, добре обладнаним лабораторіям. Проте існує досить простий метод оцінки бактеріальної забрудненості води - визначенням колі-титру. Суть його полягає в тому, що у воді визначається присутність певного типу бактерій, а саме коліформних. Це бактерії-коменсали, які знаходяться в товстому кишечнику людини. Щоденно мільярди їх потрапляють у природне середовище з екскрементами. 80-95 % цих бактерій представлено видом Eschericahia (Е. соlі). Тому наявність коліформних бактерій вказує на забрудненість води фекаліями. Коліформні бактерії зберігають життєздатність поза межами людського організму значно довше, ніж патогенні. Розроблено прості методи їх визначення, тому метод колі-титру широко використовується у всьому світі для оцінки бактеріальної забрудненості водних джерел.

Варто пам'ятати, що самі собою коліформні бактерії не є небезпечними для людини: їх наявність у воді свідчить про те, що вона забруднена фекаліями, і отже, може містити патогенні мікроорганізми. У різних країнах існують санітарні норми щодо наявності у воді коліформних бактерій; перевищення цих норм свідчить про потенційну небезпеку використання води для пиття чи купання.

Отже, колі-титр є необхідною складовою екологічної оцінки водного джерела. Розроблено різні методи виявлення й кількісної оцінки коліформних бактерій. Найпростіші з них - Хатч і Мілліпор (за назвами фірм, що їх розробили). Обидва методи базуються на здатності коліформних бактерій розмножуватися на певних поживних середовищах та утворювати там колонії, які легко виявляються неозброєним (або з використанням лупи) оком. Склад поживних середовищ підібрано так, що на них розмножуються лише коліформні бактерії.

Метод Хатч. Компанія Хатч випускає спеціальні набори для цього аналізу. Кожен з них містить пакети з поживними сумішами і пробірки з пробками (все стерилізоване). Аналіз передбачає два послідовні етапи визначення: перший - чи є взагалі у воді колі-бактерії; другий - якщо є, то скільки.

Матеріали й обладнання: 5 наборів Хатч для визначення наявності колі-бактерій (що містять сухий лактозний бульйон); 5 інших наборів Хатч - для визначення кількості колі-бактерій на 100 мл води (що містять сухий лактозно-жовчний бульйон).

 

Хід роботи

 

Якісний аналіз методом Хатч. Старанно вимийте руки з милом. Відкрийте набір. Не торкайтесь руками внутрішньої частини набору й кришки, оскільки можете занести туди бактерії. Наповніть набір водою, що аналізується, й закрийте кришкою. Зачекайте, поки поживний бульйон розчиниться у воді, потім переверніть набір, щоб внутрішня пробірка наповнилась цим розчином. Простежте, щоб у внутрішній пробірці не було бульбашок повітря. Повторіть процедуру з чотирма іншими наборами. Поставте всі 5 наборів у тепле місце, бажано в термостат при температурі 35 ± 0,5 °С. Через 1 год. знову переверніть набори, щоб видалити бульбашки повітря, яке могло виділитися з розчину внаслідок нагрівання. Поверніть набори знову до термостата.

Якщо протягом 12-24 год. у внутрішніх пробірках спостерігається газ, то коліформні бактерії присутні. Якщо газу немає, поверніть набори в термостат ще на добу. Якщо й протягом цього часу в пробірках газ не утвориться, коліформні бактерії у воді відсутні.

Кількісний аналіз методом Хатч. Проводиться лише при позитивних результатах першого аналізу. Строго кажучи, перший аналіз не дає однозначної відповіді, чи є у воді колі-бактерії, оскільки існують (хоч і рідко) інші види бактерій, що розмножуються в лактозному бульйоні, а отже, викликають виділення вуглекислого газу.

Для порівняння наявності колі-бактеріи та оцінки їх кількості проводиться другий аналіз. Розглянемо його. Відкрийте кришку другого набору Хатч й перелийте вміст першого набору в другий. Переверніть набір, щоб вилучити бульбашки повітря з внутрішньої пробірки. Повторіть цю процедуру з іншими чотирма наборами. Помістіть другий набір у термостат й витримайте його там при температурі 35±0,5 °С протягом 48±3 год. Утворення газу в пробірках свідчитиме про наявність у воді колі-бактерій. їх кількість визначте за таблицею 2.

Метод Мілліпор. Ґрунтується на застосуванні мембранних фільтрів (це тонкі пластикові пластинки з дрібними порами, що затримують всі бактерії з води, яка прокачується крізь ці фільтри). Певний об'єм води прокачується крізь фільтр на поверхню поживної суміші, бактерії розмножуються там і утворюють колонії, які легко спостерігаються неозброєним оком. Кожна така колонія представляє одну бактерію, що була у воді.

У наборі Мілліпор є інструкція, яка роз'яснює, як оцінити загальну кількість бактерій у воді й окремо колі-бактерій. Для полегшення підрахунку колоній застосовується попереднє розведення води, що аналізується, дистильованою водою - набагато легше визначити 10 колоній з 1 мл води, розведеної 99 мл дистильованої води, ніж рахувати 1000 колоній у 100 мл води. Звичайно, при остаточному підрахунку кількості бактерій вводиться поправка на розведення.

Таблиця 2

Кількість колі-бактерій у воді в залежності від утворення газу

 

Кількість пробірок	Кількість колі-бактерій на 100 мл води
без газу	з газом
		Понад 16 9,2 5,1 2,2

Виявлення соїі-бактерій на середовищі Ендо. Напередодні аналізу приготуйте 10 %-й розчин основного фуксину в етиловому спирті. Профільтруйте його перед використанням. У день аналізу в окрему стерильну пробірку налийте 0,5 мл 10 %-го спиртового розчину основного функсину, до якого додайте 10 %-й розчин сірчанокислого натрію (сульфіт) до отримання яскраво-рожевого забарвлення. Розчиніть окремо 0,5 г лактози в 2-3 мл води і прогрійте протягом 5 хв. на киплячій водяній бані. Потім до 100 мл розчиненого м'ясо-пептонного агару з рН = 7,4-7,6 долийте розчин лактози і весь розчин основного фуксину із сульфітом. Середовище розлийте по чашках Петрі, воно повинно бути кремового кольору.

На поверхню середовища, що застигло, нанесіть 0,1 мл - 1 мл води, яку розітріть шпателем Дригальського. Якщо водойма дуже забруднена органічними викидами, то зробіть розведення води і при підрахунку кількості бактерій врахуйте це розведення. Чашки Петрі поставте на 24 год. у термостат при температурі 43 °С. Проведіть забарвлення препаратів за Грамом. Наявність грамнегативних неспороносних паличок у забарвлених колоніях підтверджує їх приналежність до групи соlі-бактерій.

Підрахуйте соїі-індекс, тобто кількість соlі-бактерій, що знаходяться в 1000 мл води, та соlі-титр, тобто кількість мл води, в якій міститься 1 бактерія. Охарактеризуйте рівень забруднення водойми, враховуючи таку градацію:

соlі-титр = 100 - вода чиста,

соlі-титр =10- вода придатна для пиття,

соlі-титр = 0,1- вода непридатна для пиття.

Непридатною для пиття вважається також вода, що містить в 1 мл 100 і більше сапрофітів.

Виявлення Е. соїі методом мембранних фільтрів. Метод підрахунку бактерій на середовищі Ендо дозволяє виявити групу соlі-бактерій.

Через фільтр діаметром 30 мм пропустіть 300-500 мл чистої води або 1-10 мл розведеної у 100 разів брудної води (що відповідає 0,01-0,1 мл води досліджуваної водойми) так, щоб на фільтрі було не більше 50 колоній Е. соlі. Після фільтрування візьміть фільтр стерильним пінцетом і помістіть його фільтруючою поверхнею догори на агарове середовище Ендо тісно притискаючи його до поверхні.

Через 24 год. інкубації при 37 °С приготуйте із забарвлених колоній препарати і зафарбуйте за Грамом.

Якщо у препаратах відсутні грамнегативні неспороносні палички, це свідчить про відсутність Е. соlі. Якщо такі колонії присутні, проведіть посів у бродильних посудинах або у пробірках із поплавками, в які помістіть 10 мл глюкозо-пептинового середовища.

Помістіть пробірки в термостат при температурі 43°С на 24 год. (ця температура не дозволяє розвиватися звичайним сапрофітам). Про присутність цієї палички судять за інтенсивністю газоутворення.

1 л глюкозо-пептинового середовища містить 10 г пептону, 5 г NaCl, 5,5 г глюкози, рН = 7,4 - 7,5. Проведіть стерилізацію середовища плинною парою.

Питання для самоперевірки

1. У чому суть бактеріального забруднення води.

2. Що відноситься до мікроорганізмів водних екосистем.

лабораторна робота № 7