Лабораторная работа № 2

ОСНОВЫ ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ БИОХИМИИ

Учебно-методическое пособие

по выполнению лабораторных работ

 

 

Уфа 2012

 

 

Учебно-методическое пособие по дисциплине «Основы экологической биохимии» содержит методические указания к лабораторным работам и заданиям по разделам курса, описывающих вредные производственные факторы и способы их гигиенической оценки.

 

Составитель: Голощапов А.П., доц., к.б.н.

 

Рецензент: Зейферт Д.В., доц., д.б.н.

 

 

©Уфимский государственный нефтяной технический

университет, 2012

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1

УГЛЕВОДЫ. НЕКОТОРЫЕ ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА,

КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ

ЦЕЛЬ: изучение химических свойств углеводов, проведение качественных реакций на углеводы.

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ: глюкоза, фруктоза, лактоза, целлюлоза (фильтровальная бумага), дистиллированная вода, 10% спиртовой раствор α-нафтола, резорцин, концентрированная серная кислота, разбавленная (4%) серная кислота, 0,1н и 2н раствор NaOH, 4% раствор сульфата меди, 96% этиловый спирт, технические весы, пробирки, штатив для пробирок, пипетки, резиновые груши, спиртовки, пробиркодержатели.

1. ОБЩАЯ РЕАКЦИЯ НА УГЛЕВОДЫ С α-НАФТОЛОМ

(РЕАКЦИЯ МОЛИША)

Материалы и оборудование: глюкоза, фруктоза, целлюлоза (фильтровальная бумага), 10% спиртовой раствор α-нафтола, резорцин, дистиллированная вода, концентрированная серная кислота, пробирки, штатив для пробирок, пипетки, резиновые груши.

ХОД ОПЫТА

Опыт проводят одновременно с несколькими различными углеводами.

Помещают в пробирку 1 мл воды и вносят в нее очень немного исследуемого углевода (например, несколько крупинок сахара или же маленький кусочек фильтровальной бумаги размером 2—3 мм² (целлюлоза)). Затем добавляют 2 капли раствора α-нафтола; если применяют спиртовой его раствор, то смесь становится слегка мутной вследствие выделения малораствори­мого в воде нафтола. После этого, наклонив пробирку, осторож­но приливают по стенке (лучше из пипетки) 1 мл концен­трированной серной кислоты; тяжелый слой кислоты должен опуститься на дно пробирки, почти не смешиваясь с водным слоем. На границе слоев быстро образуется красно-фиолетовое кольцо; при взбалтывании смесь разогревается и окрашивается по всему объему, а при разбавлении ее водой выделяются окра­шенные хлопья.

В отсутствие углеводов фиолетового кольца не образуется, хотя жидкость может позеленеть или пожелтеть.

Ту же самую реакцию проводят и с резорцином (вместо 2 капель раствора α-нафтола добавляют несколько крупинок резорцина, далее также как описано выше осторожно приливают по стенке 1 мл концентрированной серной кислоты). Наблюдают красно-оранжевое окрашивание раствора.

ОБЪЯСНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ОПЫТА

Цветную реакцию с α-нафтолом (Молиш, 1886 г.) дают углеводы, причем кетозы - свободные или связанные в дисахаридах и полисахаридах - реагируют более интенсивно. Появление окраски обусловлено расщеплением молекулы угле­вода при действии крепкой серной кислоты с образованием в числе прочих про­дуктов фурфурола или его производных, которые вступают в реакцию конденса­ции с α-нафтолом, образуя окрашенные соединения. α-нафтол можно заменить другими соединениями, способными конденсироваться с производными фурфурола с образованием окрашенных продуктов. Так, резорцин дает в этих условиях оран­жево-красное окрашивание, тимол — красное, а дифениламин — синее.

В присутствии солей азотной, азотистой, бромистоводородной и иодистоводородной кислот эта качественная реакция проявляется недостаточно четко.

Эту реакцию дают и некоторые соединения, не являющиеся собственно углевода­ми, например таннин, содержащий в молекуле остаток глюкозы, а также пиро­галлол; в последнем случае при разбавлении реакционной смеси водой окраска исчезает.

Некоторые белки «глюкопротеиды» содержат связанные с пептидами углево­ды и дают реакцию Молиша. К ним относятся, например, яичный альбумин и му­цин слюны.

Наблюдение цветных реакций в форме окрашенного кольца, т. е. проведение их путем переслаивания жидкостей, часто бывает весьма удобным. Такой метод относительно более чувствителен потому, что диффузия на границе раздела двух жидкостей обусловливает наличие на разных уровнях различных соотношений концентраций реагирующих веществ, в том числе и такого соотно­шения их, которое наиболее благоприятно для появления четкой окраски.

 

1. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ УГЛЕВОДОВ С КОНЦЕНТРИРОВАННЫМИ КИСЛОТАМИ

Материалы и оборудование: глюкоза, фруктоза, дистиллированная вода, концентрированная серная кислота, пробирки, штатив для пробирок, пипетки, резиновые груши.

ХОД ОПЫТА

В пробирке растворяют несколько крупинок какого-либо сахара в 1 мл воды. К холодному раствору осторожно, по стенкам пробирки, приливают равный объем концентрированной серной кислоты, стараясь не взболтать смесь. Серная кислота образует нижний тяжелый слой под раствором сахара. На грани­це этих слоев постепенно появляется темно-бурое кольцо. Если при комнатной температуре кольца не образуется, слегка подо­гревают содержимое пробирки, не взбалтывая его.

Отмечают резкое различие внешнего вида двух полученных растворов.

ОБЪЯСНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ОПЫТА

При действии концентрированных минеральных кислот молекулы углеводов постепенно расщепляются, образуя смесь различных продуктов: фурфурол и его производные, левулиновую и муравьиную кислоты и так называемые гуминовые вещества. Сложное строение гуминовых веществ еще не может считаться точно установленным; они окрашены в темно-бурый или черный цвет, малорастворимы в воде и в условиях опыта выделяются на границе слоев жидкости. Кетозы расщепляются кислотами быстрее, чем альдозы; пробу Б можно применять для быстрого отличия фруктозы от глюкозы.

 

1. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ САХАРОВ СО ЩЕЛОЧАМИ

Материалы и оборудование: глюкоза, фруктоза, лактоза, дистиллированная вода, 2 н раствор NaOH, разбавленная (4%) серная кислота, технические весы, пробирки, штатив для пробирок, пипетки, резиновые груши, спиртовки, пробиркодержатели.

ХОД ОПЫТА

Опыт проводят одновременно с глюкозой, фруктозой и лактозой, применяя готовые 5 - 10%-ные их растворы или раство­ряя 0,2 г сахара в 1,5 мл воды.

К 1,5 мл раствора исследуемого сахара добавляют вдвое меньший объем 2н раствора NaOH, нагревают смесь до кипения и кипятят 2 мин. Отмечают изменение окраски раствора, если оно наблюдается. Затем охлаждают жидкость и подкисляют ее разбавленной серной кислотой, при этом окраска бледнеет и появляется отчетливый запах карамели (жженого сахара).

ОБЪЯСНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ОПЫТА

Все сахара, имеющие в окисной форме свободный глюкозидный гидроксил, а в открытой форме - свободную карбонильную группу, т. е. все моносахариды и некоторые дисахариды, например мальтоза, при нагревании в щелочном растворе легко осмоляются, подобно альдегидам или кетонам, образуя коричневый или черный раствор.

При осмолении образуется сложная смесь веществ; при этом сахар частично изомеризуется по различным направлениям, частично разрушается, давая молочную кислоту и другие соединения. Одновременно идет окисление сахара и получающихся из него веществ как под действием кислорода воздуха, так и в результате реакции дегидрирования. Продукты осмоления сахаров содержат несколько свободных гидроксильных групп и поэтому в отличие от альдегидной смолы хорошо растворимы в воде и особенно в растворах щелочей. В молекуле сахарозы связь между остатками глюкозы и фруктозы осуществляется за счет двух глюкозидных гидроксилов, поэтому изомеризация с образованием карбонильной группы невозможна и при действии щелочей на раствор сахарозы осмоления не наблюдается. Длительное кипячение такой смеси ведет к постепенному гидролизу сахарозы; образующиеся моносахариды осмоляются.

При действии очень слабых щелочей сахара не подвергаются столь глубоким изменениям, но все же способны изомеризоваться. Так, глюкоза в этих условиях частично переходит в маннозу и фруктозу.

Циклические (окисные) формулы для сахаров впервые предложил в 1870 г. русский химик А. А. Колли. Он же в 1879 г. в Москве впервые осуществил успешные синтезы дисахаридов.

 

1. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ САХАРОВ С СОЛЯМИ ДВУХВАЛЕНТНОЙ МЕДИ В ЩЕЛОЧНОМ РАСТВОРЕ

Материалы и оборудование: глюкоза, фруктоза, лактоза, дистиллированная вода, 0,1н раствор NaOH, 4% раствор сульфата меди, технические весы, пробирки, штатив для пробирок, пипетки, резиновые груши, спиртовки, пробиркодержатели.

ХОД ОПЫТА

Опыт проводят одновременно с глюкозой, фруктозой и лактозой, растворяя 0,1 г каждого из них в 2 мл воды.

К 2 мл раствора сахара добавляют 1 мл 0,1н раствора NaOH и 3 капли раствора сульфата меди. Выделяющийся осадок гидроокиси меди при встряхивании растворяется, и жидкость окрашивается в интенсивно синий цвет. Затем осторожно нагревают в пламени горелки верхнюю часть жидкости до начала кипения. Если сахар окисляется, то синяя окраска раствора при нагревании переходит в зеленую и затем исчезает. Одновременно появляется желтый, красный или коричневый осадок.

ОБЪЯСНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ОПЫТА

Образование легкорастворимых, интенсивно окрашенных и не разлагаемых щелочью комплексных алкоголятов меди при взаимодействии растворов сахаров с гидроокисью двухвалентной меди доказывает наличие в молекулах сахаров нескольких гидроксильных групп, расположенных рядом.

Наличие в молекуле гексозы (глюкозы) пяти гидроксильных групп было впервые установлено в 1869 г. А. А. Колли.

При нагревании в щелочном растворе сахара восстанавливают находящуюся в растворе двухвалентную медь, сами же окисляются с образованием сложной смеси водорастворимых веществ, преимущественно оксикислот. В результате образуются и ярко-окрашенные нерастворимые продукты (гидроокись меди(I) СuОН, окись меди(II) Сu₂O или металлическая медь).

Восстанавливать соединения двухвалентной меди в щелочном растворе при нагревании способны лишь те сахара, которые имеют в молекуле свободный глюкозидный гидроксил или, что-то же, свободную карбонильную группу, т. е. моносахариды, и большая часть дисахаридов и трисахаридов.

Описанная здесь реакция (проба Троммера) очень часто применяется как проба, обнаруживающая присутствие в растворе таких редуцирующих (т. е. восстанавливающих) c ахаров.

Сахароза в соответствии со своей структурой не обнаруживает в этих условиях восстановительных свойств и начинает постепенно окисляться с выделением желтого осадка гидроокиси меди(I) лишь при длительном кипячении, что объясняется образованием моносахаридов в результате гидролиза.

 

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 2

АЛЬДОЗЫ И КЕТОЗЫ.