Работа 63. Определение активности аланинаминотрасферазы и аспартатаминотрасферазы

Аминотрансферазы или трансаминазы – ферменты, содержащие в качестве коферментов фосфопиридоксаль и фосфопиридоксамин, катализируют обратимый перенос аминогрупп с аминокислот на α-кетокислоты. Определение концентрации α-кетокислот, образовавшихся в процессе трансаминирования аминокислот, лежит в основе методов определения трансаминазной активности. Существует 2 группы методов определения активности трансаминаз в сыворотке крови: спектрофотометрические и колориметрические. В основе спектрофотометрических методов лежит использование оптического теста Варбурга, эти методы наиболее специфичные и точные. Колориметрические методы основаны на образовании окрашенного динитрофенилгидразона пировиноградной кислоты, освобождающейся в результате реакции переаминирования.

Наибольшее значение имеет определение активности двух ферментов - аспартатаминотрансферазы (АсАТ) и аланинаминотрансферазы (АлАТ), поскольку эти ферменты обладают большой каталитическлой активностью. Эти ферменты находятся в различных тканях и органах: печени, миокарде, почках, скелетной мускулатуре и др. Содержание данных ферментов в тканях неодинаково (в печени намного выше, чем в миокарде).

АсАТ катализирует реакцию:

Аспарагиновая + α-кетоглутаровая → Глутаминовя + Щавелевоуксусная

кислота кислота кислота кислота

АлАТ катализирует реакцию:

α-Аланин + α-кетоглутаровая → Глутаминовая + Пировиноградная

кислота кислота кислота

В результате переаминирования под действием АсАТ аспарагиновая кислота превращается в щавелевоуксусную, а аланин под действием АлАТ – в пировиноградную кислоту. Щавелевоуксусная кислота способна в процессе ферментативной реакции превращаться в пировиноградную кислоту. При добавлении кислого 2,4-динитрофенилгидразина ферментативный процесс останавливается и образуется динитрофенилгидразон пировиноградной кислоты.

Гидразон пировиноградной кислоты в щелочной среде дает коричнево-красное окрашивание, интенсивность которого пропорциональна количеству образовавшейся пировиноградной кислоты, а по количеству образовавшейся пировиноградной кислоты можно судить об активности фермента.

Активность аминотрансфераз выражают в микромолях пировиноградной кислоты, образовавшейся 1 мл сыворотки крови за 1 ч инкубации при 37ºС. В норме активность аминотрансфераз в сыворотке крови человека невелика и составляет для АсАТ от 0,1 до 0,45 мкмоль/ч·мл, а для АлАТ – 0,1-0,68 мкмоль/ч·мл пировиноградной кислоты за 1 ч инкубации.

Исследуемый материал: сыворотка крови, печень, почки, миокард, скелетная мускулатура крысы.

Реактивы: 0,1 М фосфатный буфер (рН 7,4), субстратная смесь для определения АсАТ, субстратная смесь для определения АлАТ, динитрофенилгидразин, стандартный раствор пировиноградной кислоты.

Оборудование: весы, термостат, фарфоровая чашка, пестик, пробирки, пипетки, ФЭК, кюветы с длиной светового пути 5 мм.

ХОД РАБОТЫ. Получение сыворотки крови. Свежую негепаринизированную кровь центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин. Сыворотку осторожно отсасывают пипеткой и помещают в чистую сухую пробирку.

Приготовление гомогената. Взвешивают 500 мг ткани, тщательно гомогенизирую ее в 2 мл фосфатного буфера, после этого добавляют еще 3 мл и отфильтровывают через 2 слоя марли. Фильтрат используют для определения активности АлАТ и АсАТ.

Определение активности аланинаминотрасферазы (КФ 2.6.1.2.). Готовят инкубационные пробы согласно табл. 1.

Таблица 1

Реагенты (мл)	Опытная проба	Контрольная проба
Субстратная смесь для определения активности АлАТ	0,25	0,25
Дистиллированая вода	-	0,05
Пробы перемешать и выдержать в термостате при 37ºС 1-2 мин
Сыворотка крови	0,05	-
Пробы перемешать и выдержать при температуре 37ºС в течение 60 мин
Динитрофенилгидразин	0,25	0,25
Пробы перемешать и выдержать при комнатной температуре 20 мин
0,4 М раствор NaOH	2,5	2,50

Пробы немедленно перемешать. Выдержать при комнатной температуре 10 мин и измерить оптическую плотность опытной пробы относительно контрольной пробы при длине волны 505 нм (490-520 нм, зеленый светофильтр).

Активность аланинаминотрансферазы рассчитывают по калибровочному графику. Для построения калибровочного графика приготовить пробы согласно табл. 2.

Таблица 2

Реагент	№ проб
Дистиллированная вода (мл)	0,60	0,55	0,50	0,45	0,40
Стандартный раствор пировиноградной кислоты (мл)	-	0,05	0,10	0,15	0,20
Динитрофенлгидразин (мл)	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Все пробы перемешать и выдержать при комнатной температуре 20 мин
0,4 М раствор NaOH (мл)	5,0	5,0	5,0	5,0	5,0
Пробы перемешать, выдержать при комнатной температуре 10 мин и измерить оптическую плотность опытной пробы относительно контрольной
Содержание пирувата, нмоль	-
Активность фермента, мкмоль/(ч л)	-
Активность фермента, нмоль/(c л)	-

По результатам фотометрирования калибровочных проб построить график зависимости оптической плотности от активности фермента. По оси ординат отложить значение оптической плотности, а по оси абсцисс – активность фермента (см. табл.2). Калибровочный график должен иметь вид прямой, выходящей из начала координат. При активности АлАТ, равной 2-3 мкмоль/(ч л), сыворотку развести в 3 раза, равной 2,5-3 мкмоль/(час · л) – в 5 раз, равной 3,0-3,5 мкмоль/(ч л) – в 10 раз, равной 3,5-4,0 – в 25 раз. Провести повторное определение и учесть коэффициент разведения при расчете.

Определение активности аспартатаминотрансферазы (КФ 26.1.1.). Готовят инкубационные пробы согласно табл.3.

Таблица 3

Реагенты (мл)	Опытная проба	Контрольная проба
Субстратная смесь для определения активности АсАТ	0,25	0,25
Дистиллированая вода	-	0,05
Пробы перемешать и выдержать в термостате при 37ºС 1-2 мин
Сыворотка крови	0,05	-
Пробы перемешать и выдержать при температуре 37ºС в течение 60 мин
Динитрофенилгидразин	0,25	0,25
Пробы перемешать и выдержать при комнатной температуре 20 мин
0,4 М раствор NaOH	2,5	2,50

Пробы немедленно перемешать. Выдержать при комнатной температуре 10 мин и измерить оптическую плотность опытной пробы относительно контрольной пробы при длине волны 505 нм (490-520 нм, зеленый светофильтр).

Активность АсАТ рассчитывают по калибровочному графику. Для построения калибровочного графика пробы готовят согласно табл. 2.

Клинико-диагностическое значение. Определение активности аминотрансфераз в сыворотке крови имеет исключительно важное значение для диагностики болезней печени. В начальные периоды инфаркта через 4-6 ч наблюдается повышение активности АсАТ, через 24-36 ч оно четко выражено и лишь на 3-7-й день активность фермента снижается до нормы, изменение же АлАТ при этом небольшое.

Активность обеих трансфераз, особенно АлАТ, увеличивается при инфекционном гепатите. Особенно важное значение для диагностики имеет увеличение активности АлАТ при безжелтушных формах гепатита и в инкубационном периоде. С увеличением сроков заболевания активность аминотрансферазы постепенно снижается. У детей наблюдается более ранняя нормализация. В случае затяжного течения заболевания проявляется длительная гиперферментемия, при рецидивах и обострениях активность аминотрансфераз вновь повышается. При токсическом гепатите и обострении хронического гепатита часто наблюдаются высокие показатели ферментативной активности. Цирроз печени даже в активной фазе не сопровождается значительной гиперферментемией.