Генная инженерия

Физические карты

Сочетание рестрикционного ана­лиза с другими методами позволяет составить физические карты геномов вирусов. Физические карты вирусных геномов обозначают взаимное расположение генов, их границы, локализацию начала репликации, промоторов, лидеров, экзонов и интронов, сигнальных последователь­ностей и других генетических элементов.

В настоящее время полностью расшифрованы нуклеотидные последовательности отдельных генов и целых ге­номов Если речь идет о РНК-содержащих вирусах, то предварительным условием для дальнейшего их анализа является переписка РНК на ДНК с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскрип-тазы), после чего генетический материал может быть под­вергнут рестрикционному анализу.

Разработка новых приемов для манипуляции с нуклеиновы­ми кислотами, обычно называемых «генной инженерией», откры­ла новые возможности для генетических исследований вирусов животных. В отличие от классической и молекулярной генетики, генная инженерия имеет своим объектом не клетки, не вирусы, а гены или их группы, оперируя с ними не как с биологическими объектами, а как с молекулами или фракциями молекул. Целью генной инженерии является пересадка генов в гетерогенные системы, их экспрессия для получения кодируемых генами белков — гормонов, ферментов, антигенов и других биологически активных веществ.

Основным инструментом генноинженерных работ яв­ляются некоторые ферменты и в первую очередь рестрик-тазы. С их помощью удается получить необходимые фрагменты геномов или отдельные гены. В большинстве случаев рестриктазы образуют «липкие концы» в местах разреза молекул ДНК, что дает возможность соединять концы разных генов или генетических элементов. В тех же случаях, когда «липкие концы» не образуются, их создают искусственно, используя ферменты — концевые нуклеотидил-трансферазы. Для ковалентных сшивок нитей ДНК применяются ферменты ДНК-лигазы. Для переноса в клетку вновь образованной генетичес­кой структуры в принципе могут быть использованы сле­дующие методы: гибридизация соматических клеток, пере­садка ядер и хромосом, трансформация клеток с помощью ДНК путем введения чужеродной ДНК в зародышевые и соматические клетки животных и прямая микроинъекция ДНК в ядро клетки. Чужеродный генетический материал можно вводить в клетку с помощью вектора. Вектор — это молекула ДНК, способная к автономной репликации и используемая для переноса чужеродной генетической информации в клетку. Векторами могут быть бактериаль­ные плазмиды либо искусственные образования (би- и тривалентные плазмиды, космиды — производные фагов и плазмид). Удобными векторами для эукариотических клеток являются некоторые ДНК- и РНК-содержащие вирусы животных благодаря их способности к репродук­ции и существенному накоплению продуктов транскрипции и трансляции. К ним относятся вирусы полиомы, па­пилломы, 8У40, герпеса, аденовирусы, а среди РНК-со-держащих — ретровирусы. Одной из наиболее перспектив­ных векторных систем является крупный ДНК-содержащий вирус — вирус осповакцины.

Генная ин­женерия создает новые возможности для получения вирус­ных вакцин, и эти возможности заключаются в созда­нии вакцин, состоящих из протективных (вызывающих образование защитных антител) белков. Такие вакцины могут быть получены в прокариотических (бактериаль­ных) системах и в системах низших эукариотов (напри­мер, в дрожжах). Однако большинство протективных антигенов вирусов человека являются продуктами слож­ных внутриклеточных модификаций, которые обычно не могут осуществить клетки прокариотов и низших эукарио­тов (антигены вирусов полиомиелита, гепатита А, гриппа и др.), и в этом случае для получения вакцин необходимо использовать клетки высших эукариотов, что делает ген-ноинженерные вакцины против ряда инфекций нерен­табельными. Однако для вирусов, которые плохо куль­тивируются в лабораторных условиях (например, вирус гепатита А и ряд кишечных вирусов — возбудителей гастро­энтеритов) этот путь остается единственно приемлемым.

Среди новых направлений по созданию генноинженер-ных вакцин весьма перспективным является использование крупных вирусов животных для введения в их геном генов протективных белков вирусов. Наиболее удачной мо­делью для этих манипуляций является вирус осповакцины. Этот вирус имеет громадный геном (187 кб), в который без ушерба для репродукции вируса можно встроить до 25 ко чужеродного генетического материала, т. е. несколь­ко генов, кодирующих протективные белки вирусов. Получены штаммы вируса осповакцины со встроенным в область ранних генов гена НВ8-антигена. При внутрикожной прививке такой вакцины происходит размножение вируса осповакцины и развитие вакцинального процесса,: характерного для осповакцины. Одновременно происходят синтез НВ8-антигена вируса гепатита В, секреция его из очага вакцинации и индукция специфического иммунитета к гепатиту В. При этом реактогенность рекомбинантного штамма вируса осповакцины не только не повышается, но даже снижается по сравнению с исходным вакцинным штаммом.

Несмотря на большие успехи генной инженерии, труд­ности, стоящие перед ней, далеко еще не преодолены. Если принять за 100% путь от начала исследований до промышленного, коммерчески выгодного продукта, будь то вакцина, интерферон или гормон, то можно следующим образом оценить каждый из трех основных этапов этой задачи: получение рекомбинантных молекул на. основе про-кариотного или эукариотного вектора—10%, получение экспрессии интересующего исследователей гена — 30 %, выход на экономически выгодную технологию—60%. И тем не менее, несмотря на все эти трудности, ген­ная инженерия стала ядром современной биотехнологии и с каждым годом вклад ее в производсто будет возрастать.